[发明专利]基于免疫荧光技术的检测和定位花粉致敏原蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种基于免疫荧光技术的检测和定位花粉致敏原蛋白的方法。该方法以花粉过敏IgE阳性血清作为抗体，利用生物素标记的抗人IgE抗体可特异性地识别IgE，Alexa Flour 488标记的链霉亲和素能与生物素特异结合，通过抗原抗体的特异结合以及对信号的级联放大效应，能使花粉中微弱的致敏原信号被凸现出来，以利于用激光共聚焦显微镜（LSM710）对花粉致敏原蛋白的相关荧光信号进行检测和定位。便于在花粉颗粒上直观地观察其致敏原的分布、强弱情况。本发明为研究花粉中致敏蛋白的识别，定位提供了更为直观有效的方法。所获得数据可以为分析致敏蛋白的分布特征，了解其致敏特性，为防治人群花粉症的频发提供科学数据。

主权项

一种基于免疫荧光技术的检测和定位花粉致敏原蛋白的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：a.花粉粒预处理：将花粉用PBS缓冲液浸洗，混匀10min，离心，得到经预处理的花粉；b.花粉致敏原蛋白与血清中的IgE抗体结合：将步骤a所得经预处理的花粉与过花粉过敏病人的血清按W_花粉/V_血清=1 g：（1～5）ml的质量体积比混匀，避光22‑26℃下孵育30min；离心去除上清，再用PBS缓冲液清洗，得到结合IgE抗体的花粉，该结合IgE抗体的花粉用缓冲液清洗；c.IgE抗体（一抗）与生物素标记的抗IgE抗体（二抗）结合：将步骤b所得结合IgE抗体的花粉与生物素标记的抗人IgE抗体溶液混匀，生物素标记的抗IgE抗体的溶液浓度为2.4mg/L，结合IgE抗体的花粉与生物素标记的抗人IgE抗体溶液的质量体积比为W_花粉/V_二抗=1 g：（20～50）ml，避光22‑26℃孵育1h，离心去除上清，得到结合有抗IgE抗体的花粉，该花粉用PBS缓冲液清洗；d.生物素标记的抗IgE抗体（二抗）与Alexa Flour 488标记的链霉亲和素识别：用缓冲液稀释Alexa Flour 488标记链霉亲和素至工作浓度为0.5～2µg/ml，得到Alexa Flour 488标记链霉亲和素工作液；后将步骤c所得花粉与该Alexa Flour 488标记链霉亲和素工作液按W_花粉/V_{AF488工作液}=1 g：（10～50）ml的质量体积比混匀，避光22～26℃孵育1h，用PBS缓冲液清洗；所述的缓冲液的组成为：0.005M 磷酸钠，0.125M 氯化钠, pH 7.6；e.Alexa Flour 488荧光信号的分布观察：激光共聚焦扫描显微镜，在波长488nm的激发光下对步骤d所得花粉进行荧光信号检测。