[发明专利]一种分析感病植株代谢组诊断植物灰霉病的方法

摘要

一种分析感病植株代谢组诊断植物灰霉病的方法。本发明公开了一种基于感病植株代谢组的气相色谱‑质谱联用分析(GC‑MS)和偏最小二乘判别分析(PLS‑DA)进行植物灰霉病诊断的方法。本发明提供的灰霉病诊断方法包括样品的收集、液氮灭活、低温保存、代谢组提取、干燥、硅烷化衍生、GC‑MS检测和PLS‑DA模型的建立和检测等步骤。采用本发明的提取及检测方法能得到重现性较好的病原侵染植物代谢组结果，建立的PLS‑DA模型可实现未显症灰霉感病样本的准确识别，以及他种病原侵染和健康样本中灰葡萄孢侵染样本的准确识别。本发明灵敏准确，可为移栽苗及定植后植物灰霉病的早期诊断提供有效方法，有利于实现田间灰霉病的早期防治。

主权项

1.分析感病植株代谢组诊断植物灰霉病的方法，包括以下步骤并依次进行：植物样品的采集、灭活、保存，代谢组的提取、干燥、衍生化及GC‑MS检测；所述植物样品的采集方法为：酒精消毒剪刀后剪取植物组织2‑15g，装在写好标记的自封袋中；所述灭活方法为：将装有样品的自封袋迅速置于液氮中速冻3‑5min；所述保存方法为：将按上述方法接种、收集、灭活的植物样品置于超低温冰箱保存；所述代谢组提取方法包括以下步骤：1)冷冻研磨破碎：灭活后的植物样品在液氮条件下研磨，或采用球磨仪研磨破碎处理，得样品粉末；2)代谢组提取：称取100.0±0.5mg的植物样品粉末，准确加入1.8mL提取溶剂，采用涡旋振荡1‑3min后，继续超声提取10‑30min；3)离心处理：将2)提取获得的代谢组溶液在4000‑15000rpm下进行离心5‑15min，弃去沉淀，得代谢组提取液；所述的干燥方法为：准确移取0.6mL上清液至0.6‑2mL离心管中，30℃‑45℃抽真空离心干燥4‑8h，直至质量恒定；所述的衍生化方法包括肟化和三甲基硅烷化两步衍生化反应，步骤如下：1)吸取100μL衍生化试剂1加入已离心干燥好的样品管中，封口，超声10‑30min，涡旋1‑3min溶解，稍微离心后30℃条件下肟化衍生化反应2h；2)加入100μL的衍生化试剂2至样品管中，封口，超声10‑30min，稍微离心，37℃条件下硅烷化衍生反应4‑10h；3)衍生化获得的样品在转速10000‑15000r/min下离心15min，吸取上清液至GC样品玻璃管中，获得用于GC‑MS检测的代谢组样品；所述提取溶剂为：甲醇与水混合溶液，甲醇与水混合体积比为9.5:0.5‑5:5；所述衍生化试剂1为：甲氧基胺盐酸盐溶解于吡啶获得的溶液，浓度为10‑40mg/mL；所述的衍生化试剂2为：三甲基氯硅烷、N，O‑双三甲硅基乙酰胺、三甲基咪唑、N，O‑双三甲硅基三氟乙酰胺、N‑甲基‑N‑三甲硅基三氟乙酰胺、六甲基二硅胺烷、N‑甲基‑N‑三甲硅基乙酰胺中的任意一种；所述的GC‑MS检测方法为：选用HP‑5MS毛细管柱，程序升温，离子源和传输线温度分别为230℃和280℃，采用EI电离源，全扫描范围m/z 20～650；4)利用获得的GC‑MS检测结果进行的植物感灰霉病判别分析，包括以下步骤并依次进行：代谢组定性定量数据的导出、判别分析模型的建立和检测；所述代谢组定性定量数据的导出方法为：采用GC‑MS分析软件对检测结果进行代谢组定性和定量数据的导出，在典型样品的总离子流色谱图(TIC)中，检索NIST谱库，获得色谱峰的定性，根据硅烷化反应规律分析色谱峰的代谢物归属，对每个色谱峰选取1个目标离子、2个参考离子，创建定量数据库，设置积分参数，从样品检测数据中导出各特征离子峰面积，对代谢组成分进行相对定量；所述判别分析模型建立和检测为：模型建立采用SAS、TheX或SPASS软件的PLS‑DA工具，灰霉病感病样本与健康样本或感他种病害样本中，随机选取部分数据作为培训集，将代谢组数据与分类变量进行PLS分析，建立分类变量与代谢组数据的PLS回归模型；模型检测选取未参与建模的样本数据作为检测集未知样本，计算分类变量预测值，分析感灰霉病样本检出的准确率；其中判别分析模型的建立和检测方法是：所述判别分析模型的建立为：1)随机选取2/3样本的代谢组数据作为培训集，建立培训集的分类变量，1代表灰霉感病样本，0代表非灰霉感病样本；2)分类变量与代谢组数据的PLS分析，建立分类变量与代谢组数据的PLS回归模型，模型验证采用留一法交叉验证；所述判别分析模型的检测为：1)选取未参与建模的1/3样本的代谢组数据作为检测集；2)根据培训集建立的分类变量与代谢组数据间的PLS模型，计算检测集未知样本的分类变量的预测值(Ypred)，具体判别方法是：样本的Ypred>0.5且偏差小于0.5，则判定样本为灰霉感病样本；样本的Ypred<0.5且偏差小于0.5，则判定样本为非灰霉感病样本；样本的偏差大于0.5，则判别不稳定。