[发明专利]一种快速鉴定南方根结线虫二龄幼虫体外生存状态的方法

摘要

一种快速鉴定南方根结线虫二龄幼虫体外生存状态的方法，用尼罗红染二龄幼虫脂肪，根据虫体的着色部位鉴定出二龄幼虫的生存状态。即：将150‑180条二龄幼虫加入无菌水中，向其加1μl 0.5mg/m尼罗红溶液，25℃放置4h后，每隔24h置于用波长为580‑630mm的黄绿色激发光曝光120毫秒，观测和记录荧光值；当线虫口针到口器顶部的头部呈现出明显的橘红色荧光，判定线虫为死亡状态；当线虫头部基本没有荧光，判定线虫为非死亡状态。有益效果在于：操作简单、灵敏度高；多次检测且不影响二龄幼虫的活力；可降低假死给杀虫药物筛选带来的统计误差，减少筛选周期和成本。

主权项

1.一种快速鉴定南方根结线虫二龄幼虫体外生存状态的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：a.150‑180条南方根结线虫二龄幼虫经5％NaClO处理2min后，用无菌水洗涤以除尽残余的NaClO，经洗涤过的南方根结线虫二龄幼虫放置于装有500μl的无菌水中，再放置于25℃恒温培养箱中；b.将盛有南方根结线虫二龄幼虫的培养皿置于冰上冰浴8h；c.将40μl 1N NaOH滴加到1ml盛有南方根结线虫二龄幼虫的2ml离心管中，摇晃4min；d.将盛有南方根结线虫二龄幼虫的培养皿放置于37℃恒温培养箱中放置12h；e.将南方根结线虫二龄幼虫收集到1.5ml离心管中，14000rpm 4℃离心30min；f.上述各处理后的虫体分别用无菌水洗涤3‑5次，再将虫体放置于盛有1ml无菌水的24孔细胞培养板中，并加入2μl经0.22μm过滤器除渣并溶解于丙酮中0.5mg/ml尼罗红溶液，25℃放置4h后，置于用波长为580‑630mm的黄绿色激发光曝光120毫秒，然后，每隔24h用波长为580‑630mm的黄绿色激发光曝光120毫秒，观测和记录相应的荧光值；当线虫口针到口器顶部的头部呈现出明显的橘红色荧光，判定线虫为死亡状态；当线虫头部基本没有荧光，判定线虫为非死亡状态。