[发明专利]一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法

摘要

本发明提供了一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法，本发明的原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法获得细胞总量大，分离度高，活率高，而且细菌、真菌和其他细胞的污染概率低，同时还能够进行传代培养，为以大鼠结肠平滑肌细胞培养为基础的相关研究提供了良好的细胞培养方案。

主权项

一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：清洗和预灌流将离体的大鼠结肠使用含有2％双抗的37℃预热的D‑Hanks溶液清洗结肠内容物后，使用针头被砂纸磨平的头皮针向结肠内灌注37℃预热的预灌流液，所述预灌流液配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.6mM/L的EGTA，2％双抗和1％两性霉素；步骤2：冲洗灌流将步骤1处理后的大鼠结肠使用37℃预热的冲洗灌流液灌流冲洗，所述冲洗灌流液的配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na₂HPO₄·12H₂O，3mM/L CaCl₂，2％双抗和1％两性霉素；步骤3：复合酶消化将步骤2处理后的大鼠结肠置于37℃预热的复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；步骤4：分离培养平滑肌细胞将步骤3消化完毕的结肠使用37℃预热的D‑Hanks溶液吹打洗脱，过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到大鼠结肠平滑肌细胞，使用含10％‑20％胎牛血清、2％双抗的培养基在37℃5％CO₂的培养箱中进行培养。