[发明专利]一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制方法

摘要

本发明公开了一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制方法，所述抑制方法包括：(1)大鼠毛囊干细胞的分离；(2)大鼠毛囊干细胞的培养；(3)大鼠毛囊干细胞的纯化；(4)大鼠毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制。本发明所提供的抑制方法首次采用血管内皮细胞生长因子165为诱导因子使大鼠毛囊干细胞向血管内皮细胞高效定向分化；能够调节毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的形成与生长，促进伤口的有效愈合；也可为组织工程化皮肤的血管化、细胞移植治疗缺血性疾病等难题提供种子细胞来源。

主权项

1.一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制方法，其特征在于，所述抑制方法包括：(1)大鼠毛囊干细胞的分离：取新生1周龄SD大鼠，大鼠的体重为24±4g，颈椎脱臼法处死后，放入装有75％乙醇的烧杯消毒后取出；在超净台中，用眼科剪剪短触须并剪下触须部皮肤，75％乙醇再漂洗1次，之后用PBS漂洗3次，然后用1％Ⅳ型胶原酶和1％Dispase酶混合液37℃消化90min后，用PBS洗两次，体视显微镜下用注射器针头将毛囊脱鞘，切去两端，留下隆突部，将毛囊隆突部接种到预先包被的培养皿中，加入1ml完全培养基；(2)大鼠毛囊干细胞的培养：在37℃、5％CO2培养条件下培养1h，再缓缓加入2ml完全培养基继续培养3h，待组织基本贴壁后继续缓慢加入3ml完全培养基，之后每2‑3d换液；(3)大鼠毛囊干细胞的纯化：将100μg/ml IV型胶原按照3ml/100mm培养皿的量包被在培养皿中，室温静置1h；将100mm培养皿的原代细胞用TrypLETMSelect(1X)胰蛋白酶替代酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；(4)大鼠毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的抑制：收集纯化后的第三代细胞用于该步实验，将纯化后的第三代细胞置于含有完全培养基的培养皿中，待贴壁细胞达到60％～70％生长融合后，将上述完全培养基换成抑制培养基在37℃、5％CO2培养条件下进行诱导抑制培养，且每两天换一次抑制培养基；所述抑制培养基包括如下组分：88ml DMEM/F12培养液、10ml FBS胎牛血清、1000μl青链霉素混合液、1000μl L‑谷氨酰胺、1000μl非必需氨基酸、5‑20ng/ml血管内皮细胞生长因子165、10‑20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、0.5‑1.0μmol/L DAPT、100μl羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松。