[发明专利]一种防治HHS的抗原抗体复合物制剂的制备方法

摘要

本发明涉及生物兽药技术领域，尤其是一种防治HHS的抗原抗体复合物制剂的制备方法，其制作步骤是抗原的制备、制备灭活疫苗、免疫产蛋鸡及收集高免蛋、提取HHS卵黄抗体并纯化和制备抗原抗体复合物制剂，本发明对HHS具有特异性的防治作用，并且不存在耐药性风险，具有特效，药效长，无药残，成本低的特点，在兽医公共卫生安全方面有重要意义。

主权项

一种防治HHS的抗原抗体复合物制剂的制备方法，其特征在于，按如下步骤制得：（1）抗原的制备A:组织液的制备:收集病患鸡的肝脏，制成组织匀浆液，反复冻融3次，离心收集上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌；B：增殖：将所得滤液做适量稀释，接种10日龄鸡胚尿囊腔内，每枚鸡胚接种0.2ml，37℃孵化4d后收获尿囊腔，并测定EID₅₀;（2）制备灭活疫苗A: 将所制得尿囊液，用生理盐水稀释至10⁵‑10⁸EID₅₀/0.1ml，用终浓度为0.3的甲醛在37℃下灭活24h‑36h，即为灭活抗原；B: 制备油相：取94份的10号柏油，6份司本‑80，2份硬脂酸铝，先将硬脂酸铝与20‑30份的柏油混合加热至70‑80℃，再加入剩余的柏油和司本‑80，充分搅拌混匀后分装，而后于121℃下灭菌30分钟，冷却后备用；C: 制备水相：取96份抗原液，4份的吐温‑80，混合均匀备用;D: 乳化：按照3份油相、1份水相混合配制，先将油相加入乳化罐中50‑60rpm搅拌，缓慢加入水相，然后调节转速至180‑200rpm，搅拌5分钟，最后加入硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%,安全检验合格即可用于免疫;（3）免疫产蛋鸡、收集高免蛋选取30周龄的健康产蛋鸡，用安全检验合格的灭活疫苗进行免疫，免疫程序为：第一次免疫：每只鸡皮下注射0.2ml；第二次免疫：2周后，每只鸡皮下注射0.4ml；第三次免疫：2周后，每只鸡皮下注射1ml，产蛋鸡第三次免疫后10‑14天，开始抽样测定高免鸡蛋蛋黄中抗鸡心包积液‑肝炎综合征卵黄抗体效价，当卵黄抗体HI效价≥9log2即开始收集抗体；（4）提取HHS卵黄抗体并纯化A: 鸡蛋消毒和卵黄的收集：将高免鸡蛋清洗干净，浸入加热的37‑40℃的0.1%金保康溶液中消毒20分钟；将已消毒晾干的鸡蛋打破后，用卵黄分离器充分去除蛋清、系带，之后刺破卵黄膜，收集蛋黄置于洁净容器中，搅拌均匀;B:提取抗体：将高免卵黄与蒸馏水按照1:4的比例稀释，搅拌均匀，加入泊洛沙姆至泊洛沙姆的终浓度为1.0%，用盐酸调节溶液pH至5.0，搅拌10min后，25℃静置2个小时，待溶液分层后过滤保留上清液;C:脱脂过滤：上清液中加入体积比0.1%的甲醛脱脂，搅拌均匀后，室温静置24‑48小时，3000rpm离心20‑30分钟，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，收集上清液;D:纯化HHS抗体:向上清液中加入‑20℃的95%冰乙醇使其终浓度达到30%，22 000 r/min离心25 min，最终离心得到的产物溶解于 10ml PBS 溶液中，经透析处理除盐得到纯化的卵黄抗体;（5）制备抗原抗体复合物制剂将步骤（1）所得抗原效价含量调整10⁸EID₅₀/0.1ml‑10⁹EID₅₀/0.1ml,将步骤4所得卵黄抗体HI效价调整至8log2‑9log2,将抗原和抗体，按照抗原：抗体为1.5~4：1比例混合均匀,将混合物灭活、加入保护剂之后过滤得到抗HHS抗原抗体复合物制剂。