[发明专利]液质联用检测血浆中表儿茶素及表儿茶巯代物含量的方法

摘要

本发明公开了一种液质联用法检测血浆中表儿茶素及表儿茶巯代物含量的方法，包括如下步骤(1)含药血浆样品制备；(2)工作曲线样品的制备；(3)LC测定条件；(4)MS/MS条件(5)采用内标法定量，以系列表儿茶素及表儿茶素巯代物在空白血浆的药物浓度为横坐标，表儿茶素及表儿茶素巯代物与内标物普萘洛尔的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，权重系数为1/x2，求得的直线回归方程，即为工作曲线，使用工作曲线,将含药血浆样品中的表儿茶素及表儿茶素巯代物的药物浓度计算出来。本发明的方法快速、专属、准确、灵敏度高。

主权项

一种液质联用法检测血浆中表儿茶素及表儿茶素巯代物含量的方法，其特征是包括如下步骤：(1)含药血浆样品制备取服用含有缩合鞣质药物后的动物血浆50μL，加入10μL甲醇、20μL 100ng/mL普萘洛尔溶液、50μL 50mg/mL盐酸巯乙胺溶液，涡流混匀后，60℃水浴20min，再加入50μL甲醇，涡流混匀后，离心，取上清50μL加入50μL体积浓度为50％的甲醇水溶液,供LC/MS/MS测定；所述普萘洛尔溶液的溶剂为体积浓度为50％的乙腈‑甲醇溶液；所述盐酸巯乙胺溶液的溶剂为浓盐酸和甲醇按体积比为1：9配制而成；(2)工作曲线样品的制备①标准系列溶液的配制取表儿茶素和表儿茶素巯代物的标准品储备液母液，用甲醇配置成表儿茶素和表儿茶素巯代物的浓度均为1mg/mL的储备液，再用甲醇分别稀释，得到儿茶素和表儿茶素巯代物的浓度均为50、100、250、500、1000、2500，5000和10000ng/mL；②取8份空白血浆50μL，分别加入步骤①配得的各个表儿茶素和表儿茶素巯代物的甲醇溶液10μL，配制成相当于表儿茶素和表儿茶素巯代物在血浆中的浓度为10、20、50、100、200、500，1000和2000ng/mL的样品，再分别加入20μL 100ng/mL普萘洛尔溶液、50μL50mg/mL盐酸巯乙胺溶液，涡流混匀后，60℃水浴20min，再加入50μL甲醇，涡流混匀后，离心，取上清50μL加入50μL体积浓度为50％的甲醇水溶液,供LC/MS/MS测定；所述普萘洛尔溶液的溶剂为体积浓度为50％的乙腈‑甲醇溶液；所述盐酸巯乙胺溶液的溶剂为浓盐酸和甲醇按体积比为1：9配制而成；(3)LC测定条件液相色谱柱：Waters BEH Shield RP18柱，2.1mm×100mm，1.7um流动相：A：体积浓度0.1％的甲酸水溶液，B：体积浓度0.1％的甲酸乙腈溶液，梯度如下：0‑1分钟，流动相A从95％到90％，流动相B从5％到10％；1‑4.8分钟，流动相A从90％到84％，流动相B从10％到16％；4.8‑6.3分钟，流动相A从84％到60％，流动相B从16％到40％；6.3‑6.5分钟，流动相A从60％到5％，流动相B从40％到95％；6.5‑7.5分钟，流动相A保持5％，流动相B保持95％7.5‑7.51分钟，流动相A从5％到95％，流动相B从95％到5％；7.51‑10.0分钟，流动相A保持95％，流动相B保持5％.流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：5μL；(4)MS/MS条件：离子源：电喷雾离子源；毛细管电压：‑3.2KV；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流速：800L/Hr；锥孔气流速：50L/Hr；检测方式：正离子；扫描方式：多重反应监测；定量离子对：表儿茶素：m/z291.15→139；表儿茶素巯代物：m/z 366.25→289.15；内标普萘洛尔：m/z 260.15→116.19(5)采用内标法定量，以系列表儿茶素及表儿茶素巯代物在空白血浆的药物浓度为横坐标，表儿茶素及表儿茶素巯代物与内标物普萘洛尔的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，权重系数为1/x2，求得的直线回归方程，即为工作曲线，使用工作曲线,将含药血浆样品中的表儿茶素及表儿茶素巯代物的药物浓度计算出来。