[发明专利]一种欧李愈伤组织再生体系的培植方法

摘要

本发明公开欧李愈伤组织再生体系的培植方法一种，包括以下步骤：(1)外植体最适消毒条件；(2)诱导愈伤组织最适植物生长调节剂(PGR)浓度配比；(3)愈伤组织最适增殖的PGR浓度配比；(4)愈伤组织分化生芽最适PGR浓度配比；(5)芽诱导生根阶段最适PGR浓度配比；(6)炼苗移栽。本发明繁殖速度快、繁殖系数大，具有分化程度低，再生能力强的特点。本发明可缩短繁殖过程、改良品质、节省空间、减少劳动力、可终年生产、不受自然条件限制等特点，同时也为欧李转基因研究提供基础。

主权项

1.一种欧李愈伤组织再生体系的培植方法，其特征是：包括以下步骤：步骤(1)选取欧李生长状态优良的叶片，流水冲洗30分钟，无菌条件下，直接用体积百分比为75％乙醇对叶片表面消毒1分钟，将叶片平均分成9等份，再用质量百分比为1％NaClO对叶片分别灭菌1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟，然后采用无菌水分别涮洗7次，每次1分钟，将灭菌后的外植体接种到MS培养基+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的固体培养基上，放在每日光照18小时、黑暗6小时、温度25±1℃的培养室内进行培养，7天后统计外植体的污染率和死亡率，每组重复20个外植体，重复3次，合消毒时间为浓度为体积百分比为75％酒精4分钟和浓度为质量百分比1％次氯酸钠4分钟，统计获得欧李叶片污染率最低为0.08％和欧李叶片死亡率为39.54％；步骤(2)：取欧李生长状态优良的叶片，将消毒后的完整叶片切成1cm2(立方厘米)，茎段切成2cm(厘米)长的小段，使叶片背面和茎段伤口处充分接触到添加正交设计的不同萘乙酸(NAA)和苄氨基嘌呤(6‑BA)浓度的MS培养基上，设置6‑BA的浓度梯度是：0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L；NAA的浓度梯度是：0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L；pH值为5.6‑5.8，加空白对照共17个梯度的愈伤组织诱导培养基中进行培养，接种后的外植体放在温度为25±1℃，光照强度为2.0klx，光照时间为16小时/天的组织培养室中进行培养，15天后进行继代并统计愈伤组织诱导率，每个浓度梯度选取生长状态相近的30个外植体做重复试验，重复3次，添加植物生长调节剂浓度配比为：叶片诱导愈伤组织的培养基为MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+1.0mg/L 6‑BA+0.6mg/L NAA，且统计获得的愈伤组织诱导率达到95.31％；茎段诱导愈伤组织的培养基为MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+0.5mg 6‑BA+0.8mg/L NAA，且统计获得的愈伤组织诱导率达到92.21％；步骤(3)取生长状态良好的愈伤组织，接种到添加正交设计的不同PGR浓度的MS培养基上，促进愈伤组织生长，6‑BA的浓度梯度是：0.25mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.25mg/L、1.5mg/L；2.4‑二氯苯氧乙酸(2.4‑D)的浓度梯度是：0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L；加空白对照共21个梯度的诱导培养基培养，诱导15个梯度后进行继代，并统计的愈伤组织的生长状况，每组重复50个愈伤组织，统计获得诱导愈伤组织增殖的培养基为MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+0.5mg/L 6‑BA+0.6mg/L 2.4‑D；步骤(4)将外植体上诱导产生的愈伤组织切成小块，转接到分化芽的MS培养基上，6‑BA的浓度梯度是：2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L、5.0mg/L；NAA的浓度梯度是：0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L、0.9mg/L；加空白对照共21个梯度的诱导培养基培养，诱导30天后进行继代，并统计的愈伤组织分化芽数量，每组重复40个愈伤组织，诱导愈伤组织生芽的培养基为MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+5.0mg/L6‑BA+0.9mg/L NAA；步骤(5)将愈伤组织诱导生芽获得欧李芽切下，竖直接种到添加正交设计的不同PGR浓度的MS和1/2MS培养基上，NAA的浓度梯度是：0mg/L、0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、0.7、0.9mg/L；吲哚丁酸(IBA)的浓度梯度是：0mg/L、0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L、0.9mg/L；共24个梯度的诱导培养基培养，诱导30d后进行继代，并统计不同处理中芽的生根率，每个浓度梯度选取生长状态相近的30个幼芽做重复试验，芽诱导生根的培养基为1/2MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+0.5mg/L NAA；步骤(6)待生根的无菌苗根长长到3‑5cm即可炼苗、移栽。