[发明专利]使用流式细胞仪测定蛋白纳米颗粒分子间相互作用的方法

摘要

本发明涉及用于测定结合蛋白和靶物质之间相互作用的方法，包括使用相互作用陷阱(IT)细胞测定结合蛋白和靶物质之间相互作用的步骤。IT细胞具有展示在细胞内包涵体表面的结合蛋白，通过表达可形成包含结合蛋白的活性蛋白颗粒的融合蛋白，即不溶性聚集物(包涵体)。其使得结合蛋白的内在相互作用和活性得到表现，不影响展示在细胞中的结合蛋白活性及遗传信息。此外，本发明涉及筛选文库的方法，还包括以单个细胞单位的回收步骤。此外，本发明还涉及细胞和细胞文库，其将靶物质从细胞外导入细胞，同时保留展示在细胞内包涵体表面的结合蛋白活性和遗传信息，还包括含有编码融合蛋白的多核苷酸的结构或者表达结合蛋白展示在活性包涵体上的融合蛋白。通过使用本发明方法能够提供高通量筛选(HTS)，其中通过过表达结合蛋白敏感地标记与其相互作用的靶物质，由于与已知筛选方法相比具有显著高450倍的信噪比，HTS具有高筛选效率，能容易分离单个细胞单位，从而使用荧光显微镜或流式细胞仪可超高速寻找及提取多种文库中的相互作用蛋白。此外，通过将不易在细胞中表达的任意外源靶物质在细胞外表达后导入细胞中，本发明可快速容易地测定细胞内物质间相互作用。本发明可用于多种领域，例如开发抗体/人工抗体、制备新相互作用蛋白以及测定和优化靶蛋白和候选物质间相互作用。

主权项

1.一种用于测定结合蛋白和靶物质之间的相互作用的方法，包括：(a)提供包含构建的细胞，所述构建包括编码含结合蛋白和活性包涵体蛋白的融合蛋白的多核苷酸；(b)在所述细胞中表达所述融合蛋白以形成相互作用陷阱细胞，其中所述结合蛋白展示在所述包涵体上；(c)依据步骤(b)增加所述细胞的透性来将荧光物质共轭的靶物质导入所述细胞中，其中所述细胞保持所述结合蛋白的活性和遗传信息，其中所述增加所述细胞的透性包括使细胞膜或细胞壁裂缝，所述使细胞膜或细胞壁裂缝包括：(i)根据步骤(b)冷冻细胞；(ii)融化所冷冻的细胞；以及(iii)使用酸性溶液或螯合剂处理所融化的细胞；以及(d)基于共轭到所述靶物质的所述荧光物质的荧光强度测定所述结合蛋白和从所述细胞外部导入的所述靶物质之间的相互作用。