[发明专利]体外诱导人脂肪间充质干细胞向有功能肝细胞分化的方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及到一种体外诱导人脂肪来源的间充质干细胞(hADSCs)向有功能肝细胞(iHeps)分化的方法。该方法包括的步骤为：分离出hADSCs；体外诱导培养hADSCs向iHeps分化，诱导分化过程分为4个阶段：预处理阶段；内胚层诱导阶段；成肝诱导阶段；肝细胞的成熟阶段。使用本发明的诱导分化方法，只需要十天左右的时间就足够产生具有肝细胞形态，基因表达及功能的肝细胞，是目前用时最短的非转基因法实现肝细胞分化的方法。这将有利于个体化临床治疗方案的应用。

主权项

1.体外诱导hADSCs向iHeps分化的方法，其特征包括以下步骤：a、从人的离体脂肪组织中分离出hADSCs；b、体外诱导培养hADSCs向iHeps分化，诱导分化过程分为以下4个阶段：预处理阶段：在步骤a分离得到的hADSCs中加入含有0.5～2μM ATRA的RPMI‑1640培养基或DMEM/F12培养基，进行诱导培养，诱导时间为20～28小时；内胚层诱导阶段：将预处理后的hADSCs在含有浓度为50～200nM IDE1、1～5μΜ CHIR99021和5～20μM LY294002的RPMI‑1640培养基或DMEM/F12培养基中进行诱导培养，诱导时间为20～28小时；成肝诱导阶段：完成内胚层诱导后的细胞在含有浓度为50～200nM IDE1、10～30ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、5～20μM LY294002和50～200nM LDN‑193189的RPMI‑1640培养基或DMEM/F12培养基中诱导培养36～60小时；接着在含有浓度为50～200nM IDE1、10～30ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、5～20μM LY294002的RPMI‑1640培养基或DMEM/F12培养基中继续进行诱导培养20～28小时；肝细胞的成熟阶段：完成了成肝诱导后的细胞在含有浓度为100～200ng/mL肝细胞生长因子(HGF)、10～30ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、20～40ng/mL抑瘤素M(OsM)、1.5～3×10‑5mol/L地塞米松(Dex)以及ITS预混通用培养添加物的Williams’E培养基中进行成熟阶段的诱导培养，培养时间为112～144小时；得到由hADSCs分化而来的iHeps细胞。