[发明专利]一种从脐带和胎盘羊膜组织同时提取上皮细胞和间充质干细胞的方法

摘要

本发明涉及一种从脐带和胎盘羊膜组织同时提取上皮细胞和间充质干细胞的方法，步骤如下：⑴脐带和胎盘羊膜取材和接种；⑵间充质干细胞和羊膜上皮细胞在培养瓶中扩增和传代；⑶间充质干细胞和羊膜上皮细胞的鉴定：①细胞培养传到第三代时，胰酶消化后鉴定培养细胞的纯度：②验证细胞纯度达到90％以上，即是符合标准，即得上皮细胞和间充质干细胞的混合物。本方法成本低、简单快速，使用组织剪碎机来将脐带和胎盘羊膜剪碎成极小的碎块，极为利于直接接种到培养瓶之后细胞向组织外游移；不使用任何蛋白酶试剂，从而大幅度地降低成本，减少制备时间，使得短时间大规模细胞制备成为现实；该方法使用添加生长因子及其它营养物的细胞培养基，节省了血清。

主权项

一种从脐带和胎盘羊膜组织同时提取上皮细胞和间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤如下：⑴脐带和胎盘羊膜取材和接种：①高温消毒手术器械和大玻璃皿，同时紫外线消毒超净工作台；②配制培养基：完全培养基的组成是：DMEM/F12加完全培养基总体积5％的胎牛血清、完全培养基总体积1％的胰岛素、铁传递蛋白和硒的混合添加物，完全培养基中终浓度为20毫微克/毫升的表皮生长因子和完全培养基中终浓度为20毫微克/毫升的碱性纤维母细胞生长因子，无菌过滤，4℃保存；所述DMEM/F12中DMEM：F12的体积比为1:1；所述混合添加物及在混合添加物中的终浓度为胰岛素5微克/毫升、铁传递蛋白10微克/毫升和亚硒酸钠5毫微克/毫升；③严格筛选供者，血液化验排除传染病；④低温冰盒中运送脐带和胎盘：机械剥离胎盘羊膜之后，将脐带和胎盘羊膜分别置于大玻璃皿中，以下步骤都在无菌条件下进行，将脐带剪成1cm长的小段，将胎盘羊膜剪成约5X5cm长的方块，用磷酸缓冲盐水+总体积1％的青霉素+总体积1％的链霉素清洗组织两次，洗干净脐带的血液；⑤将脐带和胎盘羊膜组织放在4℃的磷酸缓冲盐水中，以防止组织在机械剪碎时过热而影响到细胞存活，使用组织剪碎机来分别破碎成1‑3mm的碎块，使用低速破碎组织，同时保持细胞活性，得到破碎的脐带和羊膜组织；⑥将破碎的脐带和羊膜组织分别转移到T175细胞培养瓶中，并用组织刮取器将其平铺于培养瓶底，小心加入少量完全培养基，使培养液既能覆盖破碎的脐带和羊膜组织块，又不至于使其漂浮起来，置于37℃、饱和湿度5％CO₂培养箱中培养；⑵间充质干细胞和羊膜上皮细胞在培养瓶中扩增和传代：①培养过程中观察可见细胞从组织块逐渐游移出来，并进一步实现贴壁生长和增殖，在培养的第3‑4天、当细胞生长融合成片时，用无菌磷酸缓冲盐水洗去残存的组织，全部换为新鲜完全培养基继续培养；②此后每4天换一次培养液直到细胞长满90‑100％培养瓶底面积，便进行胰酶消化传代；③胰酶消化传代：倒弃培养液，用PBS洗细胞2次，每T175用10毫升质量百分数为0.25％的胰酶‑EDTA在37℃消化10分钟，待细胞悬浮后每个T175加入1毫升胎牛血清以中和胰酶反应，1000转/分离心10分钟，再悬浮于完全培养基中，按1：4细胞数比例传代到新T175培养瓶中；⑶间充质干细胞和羊膜上皮细胞的鉴定：①胰酶消化传到第三代时，用流式细胞仪鉴定培养细胞的纯度：羊膜上皮细胞的标记物包括：角蛋白CK19，CD29，和CD34；胎盘和脐带间充质干细胞的标记物包括：CD73，CD90，和CD105；②流式细胞仪验证细胞纯度达到90％以上，化验排除常见的传染病，并排除细菌，支原体污染，即是符合标准，即得上皮细胞和间充质干细胞的混合物。