[发明专利]一种脐带间充质干细胞的分离方法

摘要

本发明涉及脐带间充质干细胞分离方法，简单操作易行，与传统爬片法相比较，细胞贴壁时间短，4-5天即可贴壁，8-10天可传代，得到大量富有活性的间充质干细胞，缩短了原代细胞的培养时间，与传统消化法相比较，接种细胞数量更多，1根脐带可接种10瓶以上T75培养瓶，原代即可收集大量细胞，传代一次可获得20倍细胞数量，生产效率高，适合大量收集低代数干细胞及规模化生产。

主权项

一种脐带间充质干细胞分离方法，其特征在于：方法由下列步骤组成：⑴取足月产健康胎儿脐带，用PBS反复冲洗干净，去除残留在脐带上的血液，获得干净脐带；⑵将脐带的1条静脉和2条动脉血管用器械钝性分离出来，保留沃顿氏胶；⑶将沃顿氏胶剪成0.5‑1cm左右小段，用镊子放入无菌烧杯中；⑷将烧杯中的脐带小段剪碎成大小为1mm³以下的组织块；⑸向烧杯中加入等体积的PBS，浸没组织块；⑹将获得的脐带组织块连同PBS通过孔径为10目孔的网筛，用无菌烧杯收集网筛下的脐带组织块，离心弃上清；⑺将离心后的组织块移入血浆瓶中，加入5倍体积的胶原酶与胰蛋白酶的混合物，37℃水浴10‑15min，转子搅拌；⑻向血浆瓶中加入1ml血清终止胰蛋白酶消化作用，将组织块与消化液收集到离心管中离心，离心后得到组织块及细胞混合物；⑼将组织块及细胞混合物转移至无菌培养瓶中，按照0.5‑1.5块/cm²的密度接种，根据收集组织块数量接种数个培养瓶；⑽向每个培养瓶中加入含血清的DMEM/F12培养基10ml，37℃，5％CO₂静置培养；⑾4‑5天后换液，以后每2天全量换液一次，8‑10天后细胞成簇生长，融合度可达到80％；⑿用PBS冲洗培养瓶，吸弃组织块，每瓶加入胰蛋白酶，消化3‑5分钟后，用血清终止消化；⒀收集终止后的消化液，1000rpm,5min离心，吸弃上清液，收获间充质干细胞。