[发明专利]Midkine稳定低表达的LM3细胞系及其构建方法

摘要

本发明涉及生物医学研究领域，具体涉及一种Midkine低表达的LM3稳定细胞系的构建方法。利用RNA干扰技术，构建Midkine稳定低表达的LM3细胞系。经过引物设计、扩增目的片断，构建Midkine shRNA重组质粒；然后收集含有病毒的液体培养基，将该液体培养基过滤后添加到预先接种LM3细胞的培养皿中共培养；最后对转染后的LM3细胞进行Puromycin抗性筛选、传代，最终获得Midkine低表达的LM3稳定细胞系。本细胞系的建立为研究Midkine在肿瘤中的分子作用机制以及对肿瘤能量代谢的调控作用提供了新的实验材料。

主权项

Midkine低表达的LM3稳定细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)从载体pSM2上扩增对应Midkine基因的shRNA片断，将其克隆到含有tGFP报告基因的慢病毒载体pLenti上，构建pLenti‑MDKshRNA重组质粒；(2)在100mm培养皿中接种HEK293T细胞；采用慢病毒转染体系，将步骤(1)获得的重组质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pVSVG按照10：9：1质量比例添加到Opti‑MEM基本培养基中，然后将转染试剂添加到上述培养基中，混合均匀后全部添加到HEK293T细胞培养基中，将该细胞放入培养箱中培养；48小时以后，收集含有MDK shRNA病毒的细胞培养液，无菌过滤并收集含有病毒的滤出液；将上述病毒滤出液添加到预先接种LM3细胞的培养皿中共培养；最后添加Puromycin抗生素筛选阳性细胞系，最终获得Midkine稳定低表达的LM3细胞系。