[发明专利]一种帕金森病三维细胞模型的制作方法

摘要

本发明涉及一种帕金森病三维细胞模型的制作方法，其具体步骤如下：(1)细胞制备；(2)模型制作；(3)模型培养；(4)细胞内总乳酸脱氢酶释放；(5)扫描电子显微镜；(6)冰冻切片；(7)HE染色；(8)免疫荧光；(10)mRNA提取；(11)定量PCR。本发明用SK-N-SH细胞为人源，弥补了动物模型不同种属的缺陷，较传统二维环境更接近人体环境，且选用细胞生长周期快，较利用干细胞的研究能缩短培养时间和降低成本。

主权项

一种帕金森病三维细胞模型的制作方法，其特征在于：该方法的步骤如下：(1)细胞制备：采用SK‑N‑SH神经母细胞瘤细胞进行培养，用含10％胎牛血清、1％的青链霉素的DMEM/F12培养基培养，在37℃、5％二氧化碳、95％空气的条件培养箱中孵育48～96小时，前24～48小时，利用终浓度为10μM～20μM全反式维甲酸诱导细胞分化；(2)模型制作：将I型胶原、10*磷酸盐缓冲液、浓度为1N的氢氧化钠溶液以及单个细胞悬浮液按照比例配制成混合液，向24孔板中，以每孔加入1ml上述混合液，在37℃、5％二氧化碳、95％空气的条件培养箱中孵育30分钟，混合液凝固成厚度为0.5～1.5mm的圆盘状模型，将该模型转入6孔板中，并加入4mlDMEM/F12培养基，使模型能够被培养基充分覆盖，并加入终浓度为10μM～20μM全反式维甲酸，在37℃、5％二氧化碳、95％空气的条件培养箱中孵育；(3)模型培养：模型孵育24小时后，换用无FBS培养基，饥饿8～12小时后，加入终浓度为1mM的MPP+溶液，对照组加入同等体积的1*PBS，处理24～72小时；(4)细胞内总乳酸脱氢酶释放：细胞内总乳酸脱氢酶释放：设置背景组、对照组和药物处理组；模型MPP+处理24～72小时后，去除培养基，1*PBS清洗，每孔加入LDH细胞毒性检测试剂盒里的LDH释放剂，倾斜放在孵箱中孵育0.5～1.5小时，使得其与模型充分接触；取上清500μl、400g，离心5分钟；配制LDH检测工作液，避光；取离心后上清，每孔120μl加入96孔板中，在相对应的每个孔中加入60μl工作液；混匀，室温，避光摇床上缓慢摇动，孵育30分钟；490nm处测定吸光度，读值应减去背景值；(5)扫描电子显微镜：三维模型药物处理24～72小时后，负压吸引器移除培养基，1*PBS清洗3次，每次10分钟；利用2.5％戊二醛固定，4℃条件下过夜；然后采用生理盐水清洗3次，每次10分钟；利用1％锇酸后固定，梯度酒精脱水，每道10分钟，叔丁醇浸泡10分钟；临界干燥机干燥后，离子溅射仪喷金，进行电镜扫描；(6)冰冻切片：三维模型药物处理24～72小时后，移除培养基，1*PBS清洗3次，每次5～10分钟；利用4％多聚甲醛固定，4℃条件下处理0.5～2小时，利用1*PBS清洗3次，每次5～10分钟；蔗糖溶液脱水，脱水后的三维模型转移至包埋盒中，并合理放置，包埋盒中载有4℃液态冰冻切片包埋剂；将包埋盒放入‑80℃冰箱，待凝固成块后送去切片，厚度20～150μm；切片装载在防脱落载玻片上；4％PFA小心滴加在样品上；(7)HE染色：1*PBS浸泡切片，5～10分钟，重复3次；苏木素5～10分钟，自来水冲洗，分化液30秒，自来水浸泡15分钟，伊红1～2分钟，自来水冲洗；常规脱水、透明，中性树脂封片；(8)免疫染色：1*PBS浸泡切片，15分钟，重复3次；1*PBS配制0.1～0.2％曲拉通，透化，1*PBS浸泡切片，10～15分钟，重复3次；1*PBS配制5％～10％牛血清封闭液，封闭30分钟；1*PBS浸泡切片，10～15分钟，重复3次；孵一抗：4℃，湿盒，过夜；1*PBS浸泡切片，10～15分钟，重复3次；孵荧光二抗或HRP～DAB，蒸馏水冲洗，复染，冲洗，封片；(10)mRNA提取：吸除培养基，每孔1ml Trizol，加入六孔板，将六孔板倾斜静置，10分钟，加入无酶EP管中；三氯甲烷200μl/ml，摇匀，静置5分钟；离心，15分钟，取水相中RNA，另取一组无酶EP管，将水相加入，并取等体积异丙醇，摇匀，‑20℃过夜；4℃，12000g，离心20分钟，去除异丙醇，加入75％乙醇，8000g，离心15分钟，去上清，7500g，离心1分钟，待酒精晾干后，加入DEPC水，重悬浮；(11)定量PCR：上述提取得到mRNA逆转录为cDNA，根据Fast Start Essential DNA Green Master说明书，配制体系；61℃退火；最后根据Ct值，并利用公式2^‑ΔΔCt相对定量计算出SNCA表达情况。