[发明专利]植物乳杆菌素plnE和plnF的异源表达方法

摘要

本发明公开一种植物乳杆菌素plnE和plnF的异源表达方法，从NCBI上查到plnE和plnF的基因序列，序列号为，并在序列的N-端添加肠激酶位点，设计酶切位点Kpn I和Nco I，合成序列；分别质粒pUC57-plnE和pUC57-plnF为模板，设计引物进行plnE和plnF片段的PCR扩增，通过pET-32a质粒和目的片段双酶切后，成功构建重组质粒pET-32a-plnE和pET-32a-plnF，转化至大肠杆菌E. coli DH5α并保存。本发明利用大肠杆菌异源表达体系，构建表达质粒并实现其在大肠杆菌的高效表达，使得大量制备PlnE/F成为可能，从而为其作用机理研究及其今后在食品领域中的应用提供基础。

主权项

植物乳杆菌素plnE和plnF的异源表达方法，其特征在于包括下述步骤：(1)从NCBI上查到plnE和plnF的基因序列，在切除前导肽序列后的plnE和plnF基因序列的5'端添加一个肠激酶位点，其基因序列为：5'‑GATGATGATGATAAA‑3'；根据质粒pET‑32a(+)的多克隆位点，选取两个酶切位点Kpn I和Nco I，序列分别为5'‑GGTACC‑3'和5'‑CTCGAG‑3'，两端最后加入保护碱基，人工合成SEQ ID No.3所示的plnE序列和SEQ ID No.4序列所示的plnF序列；(2)分别以质粒pUC57‑plnE和pUC57‑plnF为模板，PCR扩增plnE和plnF片段，分别将纯化后的plnE和plnF的PCR产物和pET‑32a质粒进行50μL体系双酶切，利用T4连接酶将酶切纯化后的pET‑32a(+)线性质粒载体片段分别与PCR酶切回收产物plnE和plnF片段进行连接，得到重组质粒pET‑32a‑plnE和pET‑32a‑plnF；(3)重组质粒pET‑32a‑plnE和pET‑32a‑plnF转化入大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)中，得到工程菌株BL21‑pET‑32a‑plnE和BL21‑pET‑32a‑plnF；(4)分别挑取工程菌BL21‑pET‑32a‑plnE和BL21‑pET‑32a‑plnF单菌落在LB液体培养基中，37℃培养过夜；按2％接种于含50μg/mL Ampr的LB液体培养基中，37℃摇菌培养至OD600达到0.6；加1mM IPTG进行诱导，200rpm的条件下诱导6h。