[发明专利]柑桔黄化脉明病毒长期离体保存方法

摘要

本发明公开了一种柑桔黄化脉明病毒长期离体保存方法，在有活性的柑桔黄化脉明病毒提取液中加入等体积的保护剂，颠倒混合后迅速置于液氮中2～3min，然后转移至‑80℃超低温冰箱保存；所述保护剂为用PBS缓冲液配制的含13～17％葡萄糖，5～7％蛋白胨以及10～30％甘油的溶液；所述的PBS缓冲液为：将NaCl 6.8～8g，Na2HPO4·12H2O 2.2～2.9g，KH2PO40.1～0.2g，KCl 0.15～0.2g，NaN30.2～0.5g，吐温‑200.5～1.5mL，1000mL去离子水溶解灭菌备用。本方法离体保存的柑桔黄化脉明病毒在保存2年后仍能保持极高的侵染活性。

主权项

1.一种柑桔黄化脉明病毒长期离体保存方法，其特征在于：在有活性的柑桔黄化脉明病毒提取液中加入等体积的保护剂，颠倒混合后迅速置于液氮中2～3min，然后转移至‑80℃超低温冰箱保存；所述保护剂为用PBS缓冲液配制的含13～17％葡萄糖，5～7％蛋白胨以及10～30％甘油的溶液；所述的用于配制保护剂的PBS缓冲液为：将NaCl 6.8～8g，Na2HPO4·12H2O 2.2～2.9g，KH2PO4 0.1～0.2g，KCl 0.15～0.2g，NaN3 0.2～0.5g，吐温‑20 0.5～1.5mL，用1000mL去离子水溶解混匀，高温灭菌后保存备用；所述有活性的柑桔黄化脉明病毒提取液由包括以下步骤的提取方法获得：1)取柑桔黄化脉明病病株组织5～10g在液氮中研磨，研磨后按照重量/体积比加入2～4倍体积的提取缓冲液进行匀浆；2)将步骤1)得到的匀浆液在冰上静置3～7min，用纱布过滤，将滤液4℃3000～5000rpm离心15～25min后取上清，将上清液用Miracloth滤膜过滤，滤液倒入超速离心管中，每管分装9mL滤液；3)在步骤2)中的离心管中从底部缓慢加入1mL蔗糖垫；4)将步骤3)中的离心管进行4℃36000～40000rpm超速离心2～3h，离心结束后用无菌针头在离心管底部扎小洞，用无菌离心管承接最初流出的1～1.3mL溶液，即为粗提液；5)将步骤4)得到的2个离心管中的粗提液倒入1个新的超速离心管中，并加入提取缓冲液将总体积配至9mL，颠倒混匀后从离心管底部缓慢加入1mL蔗糖垫，进行4℃36000～40000rpm超速离心2～3h；6)将步骤5)中的离心管用针头在离心管底部扎小洞，弃去最初流出的300μL溶液，并用无菌离心管承接随后流出的400μL病毒提取液，即得到有活性的柑桔黄化脉明病毒，冰上放置备用；以上所述提取缓冲液为用pH 7.440mM磷酸盐缓冲液配制的4～6％(w/v)的蔗糖溶液，并且含有10mM DTT；以上所述蔗糖垫为用pH 7.440mM磷酸盐缓冲液配制的65～75％(w/v)的蔗糖溶液，并且含有10mM DTT；所述pH 7.440mM磷酸盐缓冲液用K2HPO4、KH2PO4和无菌水制得。