[发明专利]外周血中分离富集造血干细胞的方法

摘要

本发明公开了一种外周血中分离富集造血干细胞的方法，步骤如下：步骤1：自体血浆的制备阶段；步骤2：羟乙基淀粉(HES)去红细胞阶段；步骤3：单个核细胞的制备；步骤4：单个核细胞(MNC)体外富集培养阶段；步骤5：CD34+造血干细胞的获得阶段。本发明从简单方便的取材中体外分离数量及纯度高的造血干细胞，以便于后期大量扩增培养，用于造血干细胞移植治疗临床造血系统疾病。

主权项

一种外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于，步骤如下：步骤1：自体血浆的制备阶段，具体如下：(1‑1)抽取病人80ml血液，至抗凝管中；(1‑2)将抗凝血1800r/m离心10min，血液分层，吸上层澄清液体即自体血浆,于56℃水浴灭活30min后，2500r/m离心10min，去除沉淀，放置于2‑8℃条件下保存1‑7天；步骤2：羟乙基淀粉(HES)去红细胞阶段，具体如下:将离心吸取血浆后剩余的下层血细胞部分，与羟乙基淀粉溶液按1:5的体积比例完全混匀，使得羟乙基淀粉质量百分比的终浓度为：1.2％，然后60×g离心10min，取上清液备用；步骤3：单个核细胞的制备，具体如下：(3‑1)将步骤2中备用的上清，用胎牛血清、不含Ca2+和Mg2+离子、pH7.2的磷酸盐缓冲液(DPBs)按1:2的体积比例稀释并混匀备用；(3‑2)吸取20ml Ficoll液，加入50ml离心管底部，并使得管壁上不要残留Ficoll液；(3‑3)将(3‑1)中稀释好的上清液缓慢铺平于Ficoll液面上，Ficoll液与上清液的体积比例为1:1.25，平衡后800×g离心20min；(3‑4)吸取白细胞层，用磷酸盐缓冲液(DPBs)稀释悬浮1600r/m离心5min后去上清；(3‑5)用磷酸盐缓冲液(DPBs)悬浮离心后的细胞沉淀1600r/m离心5min洗涤一次；(3‑6)用含质量百分比为5％的胎牛血清的RPMI 1640培养基洗涤一次，方式同步骤(3‑5)，去上清收集细胞并计数；步骤4：单个核细胞(MNC)体外富集培养阶段，具体如下：(4‑1)配置造血干细胞培养体系，由此而得造血干细胞培养基：(4‑2)用造血干细胞培养基调整细胞浓度为5×10⁶/ml，接种于75cm²的细胞培养瓶中置于37℃、5％CO₂培养箱孵育120min；(4‑3)收集培养瓶中的非贴壁的细胞悬液，转移至另一75cm²的培养瓶中置于37℃、5％CO₂培养箱培养，即可去除贴壁的细胞；(4‑4)采取1/2换液法，每3天用PBS清洗一次细胞并更换一次培养基；(4‑5)富集培养7天后，计数并检测CD34+阳性率；步骤5：CD34+造血干细胞的获得阶段，具体如下：(5‑1)培养7天后，对步骤4中的单个核细胞计数，并1400r/m离心5min收集单个核细胞；(5‑2)用不含Ca2+和Mg2+离子、pH7.2的磷酸盐缓冲液(DPBs)清洗一遍，1400r/m离心5min，弃上清；(5‑3)计算细胞浓度，按每1×10⁸个细胞用300μL Buffer液的比例重悬细胞，不足1×10⁸个细胞按1×10⁸个计算；(5‑4)(5‑3)中体系每1×10⁸个细胞加入100μL FCR阻断剂抑制非特异性或FC受体介导的结合CD34震荡15s混匀；(5‑5)(5‑4)中体系加入100μL抗CD34磁珠，震荡15s混匀，并置于4℃冰箱孵育30min；(5‑6)(5‑5)中体系加入5mLBuffer液吹打混匀，并300×g离心10min后弃上清，用500μL Buffer液重悬单个核细胞；(5‑7)选择MS+吸附柱置于磁场中，将(5‑6)中重悬的单个细胞Buffer液通过磁场中的吸附柱，未与磁珠结合的CD34‑细胞随缓冲液流出，与磁珠结合的CD34+细胞保留在吸附柱中；(5‑8)将吸附柱移出磁场后，置于15mL离心管上空，用Buffer缓冲液冲洗吸附柱即获得纯化的CD34+细胞；(5‑9)计数并流式细胞仪检测CD34⁺阳性率。