[发明专利]甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的选育方法

摘要

本发明属于油菜分子育种技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的选育方法。还涉及原生质体融合技术重组甘蓝型油菜-菘蓝的胞质和核基因组，创建重组胞质的细胞质雄性不育系。育种过程包括通过分离和提取甘蓝型油菜-菘蓝的叶肉原生质体，通过细胞融合方法获得甘蓝型油菜-菘蓝的原生质体融合的体细胞杂种；以所得的甘蓝型油菜-菘蓝的体细胞杂种菘蓝-甘蓝型油菜叶肉原生质体细胞杂种为母本，以甘蓝型油菜为父本进行多代回交，获得因雄蕊心皮化的细胞质雄性不育系；经过线粒体基因PCR扩增证实融合过程中线粒体基因组发生重组，导致核质不协调而表现出不育。

主权项

一种甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的选育方法，包括以甘蓝型油菜和菘蓝的叶肉原生质体为材料，通过原生质体融合方法得到甘蓝型油菜‑菘蓝的体细胞杂种；以所得的甘蓝型油菜‑菘蓝的体细胞杂种为母本，以甘蓝型油菜为父本进行连续五代回交和选择，获得甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系；其特征在于，包括下列步骤：(1)甘蓝型油菜‑菘蓝的叶肉原生质体融合与体细胞杂种的获得：分离和提取甘蓝型油菜‑菘蓝的叶肉原生质体，用3mM的碘乙酸处理甘蓝型油菜原生质体15分钟，用紫外光辐照菘蓝原生质体20秒，采用PEG‑高Ca²⁺、高pH融合法进行原生质体融合；将融合后的原生质体用固、液双层培养，待形成小愈伤组织后，转移到增殖培养基Pell C上进行光照培养；培养7‑10天后，挑选颜色鲜艳、大小合适的愈伤组织转入分化培养基Pell E中进行分化培养，待小芽长出后，切下小芽转入附加0.1mg/L萘乙酸的MS培养基上形成完整的再生植株；进而得到甘蓝型油菜‑菘蓝的原生质体融合的体细胞杂种；(2)细胞质雄性不育系的选育：以鉴定过的甘蓝型油菜‑菘蓝的体细胞杂种的真杂种与甘蓝型油菜华双3号进行杂交获得回交一代即BC1，观察所得的回交一代植株的雄蕊和花粉特征，选择出4个长雄蕊两两融合为一个，2个短雄蕊上没有花药，有微粉，花粉可染性差即<10％的BC1再与甘蓝型油菜华双3号进行回交，从后代植株中选择雄蕊发育异常、雄蕊转变为心皮结构的不育株为育种材料，将所得的不育株与甘蓝型油菜华双3号进行回交，每代继续选择出不育株继续与甘蓝型油菜华双3号进行回交，经过5代连续回交获得稳定的体细胞染色体数为2n＝38的不育系；(3)细胞质雄性不育系重组胞质的鉴定：提取上步所得的不育系、甘蓝型油菜‑菘蓝的体细胞杂种和甘蓝型油菜华双3号的线粒体总DNA，以已测序的登录号为GenBank:AP006444的甘蓝型油菜Westar线粒体基因组序列作参考，设计扩增线粒体基因的引物，进行PCR扩增，PCR产物回收后连接到pMD18‑T载体并转化大肠杆菌，挑选阳性克隆测序，确认所得的不育系的线粒体基因大部分来自菘蓝，在cox2‑2处与甘蓝型油菜华双3号发生了重组，重组的胞质与核基因组不协调导致不育；叶绿体基因引物TrnD‑TrnT证实不育系中叶绿体来自甘蓝型油菜，将该不育系命名为甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系CMS，其保藏号为CCTCC NO：P201511；其中扩增线粒体基因的引物序列如下所示