[发明专利]基因miR408和UCL在培育高产水稻中的应用

摘要

本发明公开了基因miR408和UCL（uclacyanin）在培育高产水稻中的应用。本发明通过分析水稻谷粒和胚胎中特异性表达的miRNA，发现miR408基因在水稻谷粒发育中具有重要的调控作用，而且这一功能是通过下调其靶基因UCL实现的。本发明还分别构建了过表达miR408、UCL‑RNA干涉和UCL‑CRISPR敲除的水稻突变株，研究显示，三种突变株均显示出生长迅速的现象，并且在成熟期时稻穗明显比野生型下垂，而且结实率增加，穗型更大，每穗粒数显著高于野生型，千粒重和产量也有显著提高。本发明为培育高产水稻提供了一种全新的并且简单有效的方法，可投入大规模推广使用，且不会对环境造成污染，食用安全。

主权项

1.UCL基因在培育高产水稻中的应用，其特征在于，所述基因UCL的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；应用的方法是沉默水稻中UCL基因的表达制备高产水稻；沉默水稻中UCL基因的表达的方法是利用RNA干涉或CRISPR敲除的方法沉默水稻中UCL基因的表达；所述RNA干涉的方法步骤如下：S1.构建UCL‑RNA干涉质粒；S11.利用pCAMBIA1305.2、pUC18‑Pubi和pZEro‑T改造得到RNA干涉载体；S12.以野生型水稻总RNA为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示引物克隆UCL基因，并且在扩增产物两端加上HindIII和BamhI的酶切位点；S13.利用HindIII和BamhI双酶切步骤S11和S12的产物，然后将两个双酶切产物用T4连接酶连接起来，即构建得到中间重组质粒；S14.用两端加有MluI和Pst I酶切位点的RNA干涉载体特异引物将克隆的片段从中间重组质粒中再次扩增出，再经MluI和Pst I双酶切后克隆到同样酶双酶切的中间重组质粒中，构建得到UCL‑RNA干涉质粒；S2.UCL‑RNA干涉质粒转化水稻愈伤组织；S3.转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化，得到UCL‑RNA干涉水稻突变株；其中，所述RNA干涉载体特异引物的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；所述CRISPR敲除的方法步骤如下：S1.构建UCL‑CRISPR敲除质粒；S11.确定miR408靶基因UCL的两个打靶位点T1和T2，在T1接头正向引物5’端加上GCCA四个碱基，在T2接头正向引物5’端加上GCCG四个碱基，T1接头反向引物和T2接头反向引物的5’端均加上AAAC四个碱基；S12.将每个靶点的正反向接头引物进行退火形成双链，然后分别连接到BsaI酶切后的pYLsgRNA‑OsU3和pYLsgRNA‑OsU6质粒片段上，产生两个sgRNA表达盒；sgRNA表达盒经两轮巢式PCR反应扩增，第一轮分别用U‑F/接头反向引物和接头正向引物/gRNA‑R分两个反应进行，第二轮用位置特异引物PT1‑F/PT1‑R和PT2L‑F/PT2L‑R分别扩增T1和T2 sgRNA表达盒；S13.对两个sgRNA表达盒的扩增产物进行纯化，并进行BsaI酶切，然后用T4连接酶将酶切产物与相同酶切的pYLCRISPR/Cas9Pubi‑H载体连接起来，即构建成靶向UCL基因的两个位点的UCL‑CRISPR敲除质粒；S2.UCL‑CRISPR敲除质粒转化水稻愈伤组织；S3.转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化，得到UCL‑CRISPR敲除水稻突变株；其中，所述T1接头正向引物、T1接头反向引物、T2接头正向引物、T2接头反向引物分别如SEQ ID NO.9～12所示；所述U‑F/接头反向引物和接头正向引物/gRNA‑R分别如SEQ ID NO.13～14所示；所述引物PT1‑F和PT1‑R，PT2L‑F和PT2L‑R分别如SEQ ID NO.15～18所示。