[发明专利]一种高通量测定化合物体外代谢稳定性的方法及应用

摘要

本发明提供了一种高通量测定化合物体外代谢稳定性的方法及应用。本发明中，使用96孔板解决了高通量问题；运用倒序的加入NADPH启动反应，并在同一时间加入终止试剂终止反应，解决了乙腈挥发的问题；还设计了不加NADPH的对照组recovery，能够计算回收率，继而发现筛选出那些不依赖于NADPH代谢的化合物。

主权项

一种高通量测定化合物体外代谢稳定性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计96孔板：准备两个96孔板，一个为体系配置板；一个为体系孵育板；体系配置板上设定有微粒体孔、回收率孔，体系孵育板上设定有空白对照孔、回收率孔、反应不同时间点孔；(2)稀释微粒体：向体系配置板的微粒体孔中加入肝微粒体28.8μl/孔，使用PBS稀释肝微粒体至蛋白浓度为0.58mg/ml，将体系配置板移至振荡器上，低速振荡30s，得到稀释的微粒体；(3)转移空白对照孔：从步骤(2)的稀释的微粒体中取出130μl，转移至体系孵化板的空白对照孔中作为空白对照组，并加入20μl的PBS；(4)微粒体与化合物混合：向体系配置板的的微粒体孔中加入10μl化合物，并低速振荡1min，得到混合微粒体；(5)转移各反应时间点孔：从步骤(4)的混合微粒体中依次取出130μl，转移至体系孵化板中的反应不同时间点孔；(6)转移回收率孔：从步骤(4)的混合微粒体中取出130μl，转移至体系配置板的回收率孔中；并加入20μl PBS和300μl含有内标的终止试剂终止反应，完成之后将体系配置板热封；(7)孵育体系孵化板：把体系孵化板放在37℃的恒温孵育器上开始温孵，在不同的时间点依次向相对应的反应不同时间点孔中加入20μl NADPH，在第35min向0min孔中加入20μl NADPH，即反应时间为0min，然后立刻向所有孔中各加入300μl的含有内标的终止试剂终止反应；(8)再次转移回收率孔：将体系配置板中所有回收率孔中的混合物对应的转移至体系孵化板的回收率孔中，将体系孵化板热封；(9)振荡离心：将体系孵化板振荡10min后，离心10min，然后取上清70μl至一个96孔浅孔板中，进LC‑MS/MS分析，检测各孔中化合物原形的质谱响应As和内标的质谱响应Ai；(10)计算清除率及回收率：利用化合物质谱响应As、内标质谱响应Ai，计算As/Ai值，计算剩余百分比，计算LN；剩余百分比(％)＝不同时间点的(As/Ai)/0min的(As/Ai)×100；LN＝ln(剩余百分比)；以时间为横坐标，以LN为纵坐标，做散点图，添加趋势线，得到线性回归方程，确定趋势线的斜率，计算清除率和回收率，清除率(CL，μl/min/mg protein)＝斜率的绝对值/微粒体蛋白浓度(单位mg/ml)×1000，回收率(recovery，％)＝(反应时间为0min的孔的As/Ai)/(回收率孔的As/Ai)×100；其中微粒体蛋白浓度是指加入含有内标的终止试剂终止反应之前的微粒体的蛋白浓度。