[发明专利]从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法

摘要

一种从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法，其包括脐带处理、从脐带和脐血管中分离细胞并进行原代细胞培养、细胞传代培养获得间充质干细胞及将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞，其中，从脐带和脐血管中分离细胞中包括采用消化液对脐带和脐血管进行消化。本发明所提供的方法可从脐带中分离和培养间充质干细胞，并将获得的间充质干细胞进行进一步诱导转化，可以用于间充质干细胞的大规模生产，在再生困难的受损组织的治疗方面具有重大的意义。

主权项

一种从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法，其包括脐带处理、从脐带和脐血管中分离细胞并进行原代细胞培养、细胞传代培养获得间充质干细胞及将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞，其特征在于：从脐带和脐血管中分离细胞中包括采用消化液对脐带和脐血管进行消化，该消化液为DMEM培养基与F12培养基1:1混合后，再加入0.5‑1.5mg/ml胶原酶、4.5‑5.5μg/ml透明质酸酶、100u/ml青霉素及100μg/ml链霉素混合配置而成；原代细胞培养中包括采用细胞培养液进行培养，该细胞培养液为DMEM培养基与F12培养基1:1混合后，再加入100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素及10％胎牛血清；细胞传代培养获得间充质干细胞包括在原代细胞培养中待细胞长至70％‑85％融合时，滴管吸取去除原代培养的培养皿中的细胞培养液，采用PBS洗涤后，再加入5‑10ml的0.25％胰蛋白酶‑EDTA溶液进行消化，于37℃下消化并观察细胞，待细胞胞体趋于变圆时，立即加入等量的细胞培养液终止消化；用吸管轻轻吹打细胞，直至贴壁细胞悬浮，离心获得所需细胞；用细胞培养液制成单细胞悬液，原代细胞按1:2进行传代培养获得第1代传代细胞；使用同样的方法重复进行第2代及第3代传代细胞的培养；将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞包括将第3代细胞以7×10⁴/ml‑1×10⁷/ml接种至培养板中，培养板中预置消毒的盖玻片，培养24h后更换为含诱导因子的诱导转化培养液，将培养板置于5％CO₂、饱和湿度80％、37℃培养箱中培养，每周换液2‑3次；其中，其该诱导转化培养液包括：含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液、10ng/ml转化生长因子βⅠ、6‑6.5μg/ml胰岛素、98‑100μmol/ml地塞米松、0.5‑1.5μmol/ml丙酮酸钠及6‑6.5μg/ml转铁蛋白。