[发明专利]一种原位检测单个活细胞内细胞器中CO2生成速率的方法

摘要

本发明公开了一种原位检测单个活细胞内细胞器中CO2生成速率的方法，属于生物荧光标记与细胞生物学领域。所述方法将TPP‑TMAE溶解于DMSO中，加入培养基，得到溶液b；将细胞器染料溶解于水中，得到溶液c；将细胞传代至两组培养皿中，培养，洗涤；向其中一组培养皿中加入溶液c，培养，洗涤，加入培养基，得到待测样品1；向另外一组培养皿中加入溶液c，培养，洗涤，加入溶液b，洗涤，加入多聚甲醛溶液，静置，洗涤，加入PBS溶液，得到待测样品2；通过对比待测样品1中细胞自身新陈代谢产生CO2导致荧光强度‑时间变化率与待测样品2中失活细胞通入气体后的荧光强度‑气体体积变化率随的数值，计算单个细胞细胞器在时间t内自身新陈代谢产生的CO2的量。

主权项

一种原位检测单个活细胞内细胞器中CO2生成速率的方法，其特征在于：所述方法具体步骤如下：(1)将TPP‑TMAE溶解于二甲基亚砜中，得到浓度TPP‑TMAE为1×10‑2mol/L的溶液a；向溶液a中加入高糖DMEM培养基，得到TPP‑TMAE浓度为1×10‑5mol/L的溶液b；(2)将细胞器染料溶解于三蒸水中，得到浓度为1×10‑5mol/L的溶液c；(3)将细胞传代至两组培养皿中，将培养皿置于培养箱中培养至细胞数达5×105±0.05×105个，移除培养基，洗涤；向其中一组培养皿的每个培养皿中各加入体积为v1的溶液c，并将所述培养皿置于培养箱中培养15～30min，移除溶液c，洗涤，加入体积为v2的高糖DMEM培养基，得到待测样品1；向另外一组培养皿的每个培养皿中各加入体积为v1的溶液c，并将所述培养皿置于培养箱中培养15～30min，移除溶液c，洗涤，加入体积为v1的溶液b，5秒后移除溶液b，洗涤，加入体积为v2的质量浓度为4％的多聚甲醛溶液，静置10min，洗涤，加入1mL pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，得到含有失活细胞的待测样品2；其中，所述培养箱培养环境：温度为37℃、CO2的体积分数为5％；一组培养皿为3～5个；所述洗涤采用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，洗涤次数为2～3次；所述v1:v2为1:10；(4)向待测样品1的每个培养皿中各加入体积为v1的溶液b，每间隔1h测试一次待测样品1中细胞内各细胞器的荧光强度，每个样品共测试6～10次；并根据测试结果绘制单个细胞细胞器内荧光强度变化率随时间t的变化曲线，得到曲线一；其中，加入溶液b时，需保持待测样品1位置不变；待测样品1中单个细胞细胞器内荧光强度变化率＝(Ii‑I0)/I0，I0表示单个细胞细胞器内的初始荧光强度，Ii表示第i次检测时单个细胞细胞器内的荧光强度，i为1～5的正整数；(5)先测试出待测样品2中细胞内细胞器的初始荧光强度；再分次向待测样品2中注入气体，测试每次注入气体后待测样品2中失活细胞内各细胞器的荧光强度；其中，每次每个待测样品2中注入气体的体积为1μL，气体的注入总量为20μL；根据测试结果绘制待测样品2中失活细胞通入气体后单个细胞器的荧光强度变化率随通入气体体积的变化曲线，得到曲线二；其中，所述气体为CO2与空气的混合气体，CO2与空气的体积比1:1；待测样品2中失活单个细胞细胞器内荧光强度变化率＝(I′k‑I′0)/I′0，I′0表示失活单个细胞细胞器内的初始荧光强度，I′k表示第k次通入气体后失活单个细胞细胞器内的荧光强度，k为1～20的正整数；(6)根据步骤(4)、(5)待测样品1和待测样品2中细胞内各细胞器荧光强度的测试结果计算单个细胞内各细胞器新陈代谢过程中CO2含量，具体为：当曲线一和曲线二中的荧光强度变化率相同时，分别得到曲线一中对应的时间t和曲线二中对应的通入气体的体积v；所述体积v中失活细胞内CO2气体的含量即为单个活细胞细胞器在时间t内自身新陈代谢产生的CO2的量。