[发明专利]基于农杆菌介导的冬芽注射的桑树转基因方法

摘要

本发明公开了一种基于农杆菌介导的冬芽注射的桑树转基因方法，是将含目的基因重组载体的农杆菌工程菌转化液直接微量注射至桑树将要萌发的冬芽中，通过农杆菌侵染冬芽顶端分生组织分生细胞和冬芽腋芽分生细胞获得成功转化的芽分生细胞，所得芽分生细胞分化生长获得转基因的桑枝条和芽，再通过桑树的嫁接无性繁殖或桑雌果和雄花的杂交有性繁殖技术获得转基因嫁接桑苗或获得转基因桑种，进而大量获得桑树转基因苗木和种子。该方法免去了诸如组织培养的繁琐步骤以及无菌的操作环境等要求，直接在植株上进行，在自然环境下即可完成，成本低廉，操作简单，技术要领掌握容易、可重复性好，转化效率较高，能够快速获得适宜当地野外自然条件的转基因植株、苗木及种子，并且适用于多种桑树品种，是一种新型、高效、实用的桑树转基因方法。

主权项

基于农杆菌介导的冬芽注射的桑树转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将含有目的基因的农杆菌工程菌接种到含有筛选压的液体培养基中进行扩大培养，当菌液OD600值达到0.8～1.2时分离菌体，用悬浮培养基重悬浮，再加入乙酰丁香酮，获得农杆菌工程菌转化液；所述悬浮培养基为含有渗透剂和表面活性剂的1/2MS培养基；（2）选取待转化桑树品种枝条上将要萌发且个体体型较大的冬芽，将冬芽生长点刺伤后注入农杆菌工程菌转化液至溢出为止，用脱脂棉包裹注射后的冬芽；重复此步骤向选取冬芽连续注射农杆菌工程菌转化液5～7次，每天1次；（3）对注射后冬芽长出的叶片进行转基因鉴定，筛选出阳性枝条；（4）筛选出的阳性枝条通过嫁接无性繁殖或桑雌果和雄花的杂交有性繁殖获得转基因嫁接桑苗或转基因桑树种子。