[发明专利]一种强耐盐抗旱甜菜的培育方法

摘要

一种强耐盐抗旱甜菜的培育方法，目的是避免传统育种的缺陷以及以往用于单基因转化的技术不足，实现将两个具有协同耐盐抗旱功能的Na+/H+逆向转运蛋白基因ZxNHX和液泡膜H+‑焦磷酸酶基因ZxVP1‑1聚合，通过遗传转化获得共表达ZxNHX和ZxVP1‑1的转基因甜菜新品种(系)，提供一种强耐盐抗旱、高含糖量甜菜的培育方法；其步骤包括幼苗培养、实生苗侵染、分子鉴定和抗逆性评价。该方法大大缩短了转基因幼苗培育时间，整个周期控制在5个月左右，无需通过愈伤组织，且遗传转化效率高达10%，培育的甜菜含糖量明显增加、耐盐抗旱性显著增强。

主权项

一种高效遗传转化甜菜的方法，其主要步骤为：(1) 实生苗的培养：挑选籽粒饱满，均匀一致的甜菜种子播种到预先浇透水的蛭石中，置于暗光下，待种子萌发并两片子叶完全露出蛭石表面后，移至光照条件下，并浇灌1/2 Hoagland 营养液进行培养；培养条件为昼夜温度(28±2)℃/(23±2)℃，光照时间16 h·d‑1，光强600 µmol·m‑2·s‑1，空气相对湿度60%‑80%；(2) 甜菜实生苗的遗传转化：步骤(1)的甜菜幼苗培养至15 d时，用无菌蒸馏水润洗叶片表面，以去除表面的灰尘；然后用无菌手术刀轻轻切除顶芽，只保留2片子叶，伤口用浸泡过携带耐盐、抗旱基因ZxNHX和ZxVP1‑1载体的根癌农杆菌GV3101菌液的无菌脱脂棉包裹，并每隔30 min用注射器将根癌农杆菌菌液注射至脱脂棉上，以维持脱脂棉湿润，所述菌液OD600=0.6‑0.8；野生型对照植株用无菌水代替农杆菌菌液侵染；将侵染的甜菜幼苗置于黑暗条件下，使伤口与根癌农杆菌充分接触3 h后，去除脱脂棉，并将其置于步骤(1)所述的培养条件下培养；5 d后，伤口处重新长出幼芽；15 d后，长出第2层真叶，此时切除起初保留的2片子叶，并将幼苗移植到装有蛭石的塑料盆中培养；30 d后，长出第3层真叶，共获得400株遗传转化植株；(3)遗传转化植株的分子鉴定：提取以步骤(2)获得的转化植株新叶DNA和总RNA，采用PCR和RT‑PCR法鉴定出40株转化植株的基因组含有外源基因ZxNHX及ZxVP1‑1，转化效率达10%；(4) 转基因株系的耐盐抗旱性鉴定：以步骤(3)鉴定的转基因株系分别在400 mmol/L NaCl的高盐和‑1.0 MPa渗透势的中度干旱胁迫处理8 d和5 d后，对其耐盐抗旱性进行评价；与野生型对照相比，过量表达ZxNHX及ZxVP1‑1的转基因甜菜株系表现出更强的耐盐性和抗旱性，块根含糖量明显增加。