[发明专利]低血清培养Marc‑145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH‑1R株病毒的方法

摘要

本发明公开了低血清培养Marc‑145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH‑1R株病毒的方法，属于兽医生物学技术领域，它包括以下步骤S1.制备用细胞的传代与培养；S2.驯化细胞适应低血清培养基；S3.驯化细胞适应低血清培养环境；S4.细胞毒种的繁殖。本发明提供的低血清培养Marc‑145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH‑1R株病毒的方法，可以显著降低生产成本，同时可以提高下游纯化的效率，并且能够快速稳定的扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。

主权项

低血清培养Marc‑145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH‑1R株病毒的方法，其特征在于，它包括以下步骤：S1. 制备用细胞的传代与培养：取T75瓶培养铺满单层Marc‑145细胞，经EDTA‑胰酶细胞分散液消化细胞，用细胞生长液吹打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将Marc‑145细胞置于温度为37±2℃的二氧化碳培养箱中培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养，上述细胞生长液为10%血清含量的DMEM或MEM培养液；S2. 驯化细胞适应低血清培养基：包括以下子步骤：S21. 第一代细胞的驯化：将步骤S1扩大培养的Marc‑145细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所述第一代低血清培养基为含10%血清的DMEM或MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为2:1，其中血清的含量为8.3%；S22. 第二代细胞的驯化：将驯化的第一代Marc‑145细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述第二代低血清培养基为含10%血清的DMEM或MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:1，其中血清的含量为7.5%；S23. 第三代细胞的驯化：将驯化的第二代Marc‑145细胞接种到第三代低血清培养基中进行驯化，所述第三代低血清培养基为含10%血清的DMEM或MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:2，其中血清的含量为6.7%；S24. 第四代细胞的驯化：将驯化的第三代Marc‑145细胞接种到第四代低血清培养基中进行驯化，所述第四代低血清培养基为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为5%；S3. 驯化细胞适应低血清培养环境：使用T75细胞瓶，37℃静态培养驯化的第四代Marc‑145细胞，培养液为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为1～5%，即为生产用种子细胞；S4. 细胞毒种的繁殖：用病毒培养液将猪繁殖与呼吸道综合征CH‑1R株病毒毒种按2%（v/v）的比例接种到生产用种子细胞单层中进行培养，培养66～80h后收获病毒；其中，所述EDTA‑胰酶细胞分散液为质量分数为0.10～0.25%的胰酶和0.02%的EDTA的Hank’s液的混合液；步骤S1中所述细胞生长液为低血清培养基和血清的混合液，其中低血清培养基中血清的含量为1～5%；步骤S4中所述的病毒培养液为低血清培养基、血清和抗菌素的混合液，其中，血清的含量为0～1%，抗菌素的含量为100～200IU/mL，且混合液的pH值为7.2～7.4。