[发明专利]一种用于表皮损伤修复的改良式脂肪干细胞

摘要

本发明公开了一种用于表皮损伤修复的改良式脂肪干细胞，通过脂肪干细胞的分离及体外培养，构建了含有p63基因的慢病毒载体，所述的含p63基因的重组载体是pLV.EX3d.P/neo-EF1A>TP63/flag>IRES/eGFP，利用慢病毒将p63基因转载至脂肪干细胞，通过Q-PCR检测，其表达超过未转染的脂肪干细胞，改良后的脂肪干细胞向表皮细胞的分化能力超过未转染的脂肪干细胞，达到快速有效的覆盖并修复创面的效果，本发明具有目的基因的转导效率高，能够比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达的特性；同时具有取材方便、生长迅速、自体组织无排异反应等优点。广泛应用于烧伤、整形外科领域。

主权项

一种用于皮肤组织缺损修复的改良式脂肪干细胞，通过脂肪干细胞的分离及体外培养，构建了含有确定基因的慢病毒载体，利用慢病毒将确定基因转载至脂肪干细胞，通过慢病毒转染人脂肪干细胞，促进人脂肪干细胞向表皮分化，其特征在于，具体通过如下方法制备获得：（1） 脂肪干细胞的分离及体外培养鉴定：无菌获取人脂肪组织并进行体外培养鉴定，以胶原酶振荡消化后离心收集细胞，常规传代及冻存,并对细胞进行细胞生长曲线及CD44、CD45、CD29、CD105表面标志物的流式细胞鉴定；（2）脂肪干细胞的多向分化潜能鉴定：对所获人脂肪干细胞分别进行成脂和成骨分化鉴定，即分别以成脂和成骨诱导液诱导细胞，2周后分别对成脂细胞和成骨细胞进行油红染色和茜素红染色的鉴定；（3） 构建含p63基因的慢病毒载体：从GeneBank 中查寻p63基因序列，设计引物，分别以attB1‑Koza k‑TP63‑F，attB2‑flag‑R为引物，进行目的基因TP63的PCR 扩增；再利用Gateway Technology构建pDown‑ TP63‑flag，最后利用Gateway Technology构建pLV.EX3d.P/neo‑EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP慢病毒载体，通过菌落PCR筛选阳性克隆，挑取阳性克隆质粒并测序；（4）将上述制备的含p63基因的慢病毒载体转染到人脂肪干细胞：所获得的pLV.EX3d.P/neo‑EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP慢病毒载体转染到293FT细胞中，进行病毒包装，收集培养上清对病毒进行荧光表达观察及滴度测定；最后将Lenti‑TP63‑eGFP/Neo和Lenti ‑eGFP/Neo加入人脂肪干细胞，通过脂质体进行转导；荧光显微镜下观察转导效果，并进行PCR、WB和免疫荧光检测；（5）利用p63基因的作用促使脂肪干细胞向表皮细胞分化。