[发明专利]从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法

摘要

本发明公开了一种从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法，属于生物制药技术领域，以动物肺脏为原料，选用水解酶对动物肺脏的盐水提取物进行组合酶降解，随后在酶解液中加入氧化剂和活性炭进行氧化吸附脱色，然后采用丙酮对氧化后的溶液分级沉淀，并脱水干燥制得硫酸乙酰肝素粗品，然后对粗品硫酸乙酰肝素的水溶液依次采用膜分离和阴离子交换层析，将硫酸乙酰肝素与硫酸皮肤素、硫酸软骨素、肝素等杂质分离，再使用5000-7000Da的超滤膜对洗脱液进行超滤浓缩，最后使用凝胶过滤层析脱盐并冻干，得硫酸乙酰肝素精品。本发明从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法，工艺条件简单，易于实现，且原料易于获取，成本低，所得硫酸乙酰肝素纯度高。

主权项

一种从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)盐水提取：将肺脏捣碎，然后加入其重量30‑40倍2％的NaCl水溶液(w/v)，温度控制在90‑95℃，搅拌5‑6h，离心，分别收集上清液和沉淀，向沉淀中加入80‑120倍2％的NaCl水溶液(w/v)，重复上述操作2‑3次；2)酶水解：合并步骤1)中的上清液，调节pH为9‑11，温度为40‑50℃，加入水解酶，搅拌20‑24h，然后升温至90‑95℃，保温2‑3h，离心，弃去沉淀，向上清液中加入乙醇，沉淀12‑18h，得沉淀物；3)氧化脱色：在步骤2)所得的沉淀物中加入其重量30‑60倍的2％NaCl水溶液，控制溶解液温度为40℃‑50℃，pH为9‑11，加入溶解液体积0.1％的KMnO₄和0.2％的活性炭，室温搅拌6‑8h，离心去除沉淀，向上清液中加入1倍体积的乙醇沉淀12‑18h，得沉淀物；4)丙酮分级沉淀：在步骤3)所得的沉淀物中加入其重量30‑60倍的2％NaCl水溶液，搅拌溶解，加入0.6‑1.3倍体积的丙酮，沉淀12‑18h，离心收集沉淀，重复上述操作3次，向沉淀物加入2‑3倍体积的乙醇，充分搅拌，静置过滤去除乙醇，真空干燥得硫酸乙酰肝素粗品；5)超滤：向硫酸乙酰肝素粗品中加入80‑120倍体积纯化水，搅拌溶解，循环超滤3‑5h，收集截留液；6)离子交换柱层析：选择强阴离子交换树脂对5)中的截留液进行交换吸附，先以2‑3倍体积的0.5‑1mol/L的NaCl溶液进行洗脱；再用2‑3倍体积的1.5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集洗脱液；7)凝胶过滤层析：对6)中的洗脱液进行凝胶过滤层析，收集洗脱液；8)浓缩：对7)中的洗脱液进行超滤为原体积的1/20‑1/30，收集截留液；9)凝胶过滤脱盐：对8)中的洗脱液进行凝胶过滤脱盐，收集洗脱液；10)冻干：将步骤9)所得的洗脱液冻干，得到硫酸乙酰肝素精品。