[发明专利]一种新的治疗肺癌的Derp1纳米疫苗及其制备方法和用途

摘要

一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗及其制备方法和用途，其方法是先采用基因工程技术在大肠杆菌中克隆和表达制备Der p1蛋白，然后应用生物可降解的PGLA纳米粒子作为包裹材料制备PLGA‑尘螨应变原Der p1﹙PLGA‑Der p1﹚纳米疫苗，即为本发明产品。本发明所揭示的一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗，具有良好的抗癌功能，对肺癌有着显著的治疗效果，既对人体无毒害作用，还能增加机体免疫能力，且制备工艺简单。

主权项

一种Der p1纳米疫苗在制备治疗肺癌药物上的应用，其特征是所述Der p1纳米疫苗采用如下方法制备：步骤一，用基因工程技术制备重组屋尘螨变应原Der p1：（1）挑取单个含重组表达质粒重组pET‑24a(+)Der p1的基因工程菌菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的LB中，35~37℃，160~240rpm摇菌过夜，按1~4%的接种量将基因工程菌菌落接种于LB/kam培养液中，200~300rpm摇菌至OD600为0.5~0.7时，加入IPTG使其终浓度为0.1~0.4mM，诱导4~6小时后，2000~4000g在2~6℃离心5~15min，去上清，沉淀用1xPBS洗涤，将细菌重悬于40ml 1xPBS/5mM EDTA中，加入溶菌酶至终浓度0.4~0.6mg/ml，DTT至终浓度5~15mM，PMSF至终浓度0.8~1.2mmol/L，Triton X‑100至终浓度0.8~1.2%，并于室温中振荡20~40分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，‑80℃保存；（2）将裂解液置于冰浴下40W超声5~15遍，超声20~40s、停20~40s，直至菌体不粘为止，10000~12000g3~5℃离心10~20min，去上清，得基因工程菌包涵体；（3）在冰浴下，用100ml包涵体洗液1重悬沉淀，并磁力搅拌20~40min，10000~12000g3~5℃离心10~20min，去上清，再依次用包涵体洗液2和包涵体洗液3重悬，冰浴磁力搅拌，离心去上清，最后将沉淀溶于20ml包涵体溶解液中，10000~12000g离心30min，弃沉淀，得包涵体；由于重组蛋白N‑端带有6‑His标签，故通过Ni2+金属螯合层析进行重组Der p1亲和层析纯化，得重组屋尘螨变应原Der p1；步骤二，制备PLGA‑尘螨应变原Der p1﹙PLGA‑Der p1﹚纳米疫苗：称50mg PLGA溶于二氯甲烷中，再加入100μL已制备好的浓度为100mg/ml的重组屋尘螨应变原Der p1，混旋1min，40w超声乳化1 min形成初乳液，再加入2ml 浓度为2%的聚乙烯醇(PVA)，再超声乳化1~2 min，形成复乳液，然后将复乳液转移至50ml的双蒸水中，室温下搅拌3~5h，使有机溶剂充分挥发，10000rpm/ min离心10min，离心收集微粒，再用双蒸水洗涤，最后真空冷冻干燥成微粒粉末状的PLGA‑尘螨变应原Der p1纳米疫苗，4℃保存；所述步骤一（1）中的基因工程菌菌落接种量为2%；摇菌至终浓度为0.2mM；PMSF至终浓度为1mmol/L；Triton X‑100至终浓度为1%；其特征是：所述步骤一（3）中的包涵体洗液1为50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA；包涵体洗液2为50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA，2%Triton X‑100；包涵体洗液3为50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA，4mol/L尿素；包涵体溶解液为50mmol/L PB PH8.0，300mmol/L Nacl，20mmol/L咪唑，6mol/L尿素；所述步骤二中的所述的PLGA为LA:GA=65:35，Mw=40000‑75000。