[发明专利]一种用农杆菌转染棉花花粉的遗传转化和筛选方法

摘要

本发明公开了一种用农杆菌转染棉花花粉的遗传转化和筛选方法，属于遗传转化方法技术领域。本发明通过配制特异的农杆菌感染的花粉萌发培养基；将带有双元载体质粒pCB4-bar的农杆菌通过真空渗透感染刚萌发的花粉，再将感染后的花粉授粉于柱头，通过花粉管途径将遗传物质传递给子代，获得转基因植株。本实验以抗除草剂基因bar作为目的基因，通过农杆菌转染花粉法转化棉花，同时优化部分影响转化的因素，筛选出适合转化的最适条件，优化后的农杆菌感染花粉的转化率可达1.3％，获得的转化后代植株Basta抗性分离符合3:1分离规律，该方法操作简单，无设备和仪器的特殊要求，为棉花转基因育种提供技术支持。

主权项

一种用农杆菌转染棉花花粉的遗传转化和筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：1)配制农杆菌感染的花粉萌发培养基：花粉萌发培养基包含的组分为0.5mMKNO₃，2.7mM MnSO₄，1.7mM H₃BO₃，0.5mM MgSO₄·7H₂O，1.5μM GA₃，pH 7.5，质量浓度为40％～45％的蔗糖；花粉萌发培养基配制后高压灭菌，然后分装获得液体培养基，封口膜密封，4℃保存备用；2)转化方法：挑取带有双元载体质粒pCB4‑bar的农杆菌，在YEP液体培养基中培养，培养条件为摇床转速180～220rpm，28℃，振荡培养过夜；当菌液的OD₆₀₀值为0.6～0.8时，3000r/min离心10min收集菌体，重悬于步骤2)配制好的花粉萌发培养基中；收集新鲜的棉花花粉浸泡于该菌液中，花粉浓度为100g/L，加入1‰体积比的Tween‑20并抽真空，压力‑80Pa，持续20min；将浸过农杆菌的花粉用毛笔涂抹于去雄过的棉花柱头，然后在柱头上套上一端封闭的麦管；待棉花种子成熟后，收集棉花种子；3)转基因棉苗的筛选：将步骤2)获得的棉花种子播种后，待棉花幼苗进入三片真叶期时，采用0.3ml/L浓度的Basta溶液进行涂抹筛选，3d后观察涂抹叶片未出现坏死斑点的植株，确认为转化成功的转基因棉苗。