[发明专利]一种培育杨树转抗虫基因的方法

摘要

本发明涉及一种培育杨树转抗虫基因的方法，其特征在于：采用优良品种杨树为试材，进行组培再生、农杆菌介导的抗虫基因转化及转基因植株的抗虫性试验，建立高效的外植体再生体系、进行遗传转化条件试验，确定叶片及茎段外植体对潮霉素抗性的临界浓度、获得转基因再生植株，组培快繁了大量转基因杨树苗。本发明应用于国家三北防护林建设以及绿化环保、防风固沙等公用事业以及林纸一体化建设项目，转基因杨比较一般杨树具有抗虫害、速生、纤维含量高等优越性，在造林绿化、防止土地沙化等方面具有广阔的市场前景。

主权项

一种培育杨树转抗虫基因的方法，其特征在于：采用优良品种杨树为试材，进行组培再生、农杆菌介导的抗虫基因转化及转基因植株的抗虫性试验，建立高效的外植体再生体系、进行遗传转化条件试验，确定叶片及茎段外植体对潮霉素抗性的临界浓度、获得转基因再生植株，组培快繁了大量转基因杨树苗；试验选用的材料为：（1）、菌种和质粒：含Bt基因的植物表达载pCUBVgb转化的根癌农杆菌LBA4404；（2）、植物材料：欧美杨107；（3）、供试昆虫：榆毒蛾幼虫和天幕毛虫幼虫；（4）、化学试剂：卡那霉素、羧苄青霉素、潮霉素、利福霉素；扩增引物、Taq酶；（5）、培养基：农杆菌培养基、蔗糖、酵母提取物、琼脂；叶片、生根培养基；培育杨树转抗虫基因的方法按下列步骤：（1）、潮霉素临界浓度的确定：设计4个潮霉素的浓度梯度，在杨树不定芽分化培养基中加入上述浓度的潮霉素，取生长健壮的无菌苗叶片及茎段置于培养基中，定期观察分化情况确定叶片及茎段对潮霉素的抗性浓度；（2）、菌种的活化将含有植物植物表达载体的农杆菌菌液置于恒温箱中，培养形成单菌落；挑取农杆菌单菌落，接种于液体培养基中用于转化；（3）、叶盘法转化杨树：利用叶盘法对杨树进行抗虫基因转化，取生长健壮的无菌苗叶片和茎段，投入到用MS液悬浮稀释的菌液中，转入选择分化培养基中培养；（4）、转化植株：经过农杆菌侵染的叶片及茎段外植体在芽选择分化培养基上，有抗性芽产生，将抗性芽同外植体一起继续进行选择培养，转移至生根培养基上诱导生根；（5）、转化植株的鉴定：采用潮霉素抗性鉴定、转基因植株的PCR检测、植物总DNA的提取、总DNA的PCR扩增：以转化植株中提取的植物总DNA为模板，用PCR仪检测转基因植物中外源基因的整合情况，以未经转化的107杨DNA的PCR产物为阴性对照；（6）、转基因植株抗虫活性测定、转基因植株苗其生长与形态观察，求平均值和标准差进行检验，观察生长正常的一年生和两年生苗木的干形、分角、叶片形态。