[发明专利]用于定位竹类植物组织内源激素IAA的改良方法

摘要

本发明公开了一种用于定位竹类植物组织内源激素IAA的改良方法，其是在目前已有的免疫金银染色方法的基础上做的改良，用TBS替代PBS作为实验中缓冲液以及溶剂，TBS不会与钙离子等产生沉淀，且对生物反应的干扰极低，因此背景一些非特异性显色干扰降低，提高了结果的准确性；通过在显色液中加入明胶，将显色时间基本控制在了15‑20min，显色期间有足够的时间检查显色程度，得到了很好的重复率；将二抗在室温下孵育，缩短了反应时间；本发明的方法不仅步骤得到了精简，而且反应条件温和、显色易控，可以得到更精美、准确的图像，在竹类植物内源激素的免疫定位中具有极好的应用和推广价值。

主权项

用于定位竹类植物组织内源激素IAA的改良方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品固定：首先将竹笋或节间停止生长的竹杆放入前固定液中，4℃抽气4h，所述前固定液为2％EDAC，然后移除前固定液，将后固定液浸没样品，4℃抽气过夜，所述后固定液为含有4％多聚甲醛和0.5％戊二醛、浓度为0.025mol/L、pH＝7.2的PBS；(2)包埋、切片：将固定好的样品用TBS冲洗3次，每次10min，所述TBS为含有0.15mol/L NaCl、浓度为0.05mol/L、pH＝7.2的Tris‑HCl缓冲液，之后系列脱水剂脱水、浸蜡、包埋样品，然后将包埋好的样品切片，并将切片粘在载玻片上于40℃展片台上展片，常温晾干；(3)脱蜡复水：采用常规的方法对晾干的切片进行脱蜡复水，然后用TBST①浸洗3次，每次5min，所述TBST①为含有0.3％ Triton X‑100的TBS；(4)封闭：将玻片上材料周围的TBST①吸干，每片玻片加200μl封闭液，室温封闭45min，所述封闭液为含有5％ BSA和1.5％甘氨酸的TBST①；(5)一抗孵育：倾去玻片上的封闭液，吸干材料周围的封闭液，加入一抗孵育液，每片100μl，4℃孵育过夜，前述一抗孵育液为兔抗IAA抗体：封闭液＝1：70；(6)一抗清洗：倾去玻片上的一抗孵育液，先用TBST①冲洗玻片5次，每次5min，再用TBST②浸洗玻片5次，每次5mim，所述TBST ②为含有0.1％Tween‑20的TBS；(7)二次封闭：吸干材料周围的液体，加封闭液，每片200μl，在保湿培养皿内室温孵育15min，所述封闭液为含有5％BSA和1.5％甘氨酸的TBST①；(8)二抗孵育：倾去封闭液，吸干材料周围液体，加入二抗孵育液，每片100μl，放于保湿培养皿内室温孵育6h，前述二抗孵育液为金标羊抗兔抗体：封闭液＝1:40；(9)二抗清洗：先用TBST②冲洗载玻片5次，每次5min，再用TBST②浸洗5次，每次5min，最后超纯水浸洗10min；(10)显色：将玻片垂直浸入显色液中，避光显色15min，所述显色液由1.7g对苯二酚、0.05g硝酸银、2.55g柠檬酸、2.35g柠檬酸钠与60ml明胶溶液混合、并用超纯水定容至100ml得到，在所述明胶溶液中明胶的含量为0.5％，显好色的玻片迅速浸入超纯水中停止显色；(11)脱水、封片：将玻片按照与脱蜡复水相反的顺序和时间依次脱水，然后用树脂封片，铅块压片至树脂凝固；(12)光学显微镜观察、拍照。