[发明专利]一种电化学发光适配体传感器、其制备方法及其用途

摘要

本发明涉及一种电化学发光适配体传感器、其制备方法及其用途，更具体而言，本发明涉及一种基于Eu(III)-MWCNTs作为发光材料构建的电化学发光适配体传感器、其制备方法，以及由该方法制备的电化学发光适配体传感器在测定凝血酶中的用途。本发明的电化学发光适配体传感器表现出优良的准确性、稳定性、重现性与高的灵敏度，对推广适配体传感器在疾病预防、疾病诊断和药物筛选中的实际应用具有重要的意义。

主权项

 一种电化学发光适配体传感器的制备方法，所述电化学发光适配体传感器包括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰金掺杂的石墨烯、捕获探针与凝血酶适配体的混合溶液、巯基己醇(MCH)、含0.15 U/μL RecJ_f的凝血酶、NH₂‑DNA1和NH₂‑DNA2的混合溶液和Eu(III)‑多壁碳纳米管(MWCNTs)，所述参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为铂丝电极，所述捕获探针为5'‑SH‑(CH₂)₆‑AAT TGG AGT CAC CCC AAC CTG CCC TAC CAC GGA CT‑3'，凝血酶适配体为5'‑AAA AGT CCG TGG TAG GGC AGG TGG GGG TGA CT‑(CH₂)₆‑3' ，所述NH₂‑DNA1片段序列为5'‑NH₂‑(CH₂)₆‑AGT CAC CCC AAC CTG CCC TAC CAC GGA CTT GAA ACA GTC CGT GGT AGG GCA GGT TGG GGT GAC TCC AAT T‑(CH₂)₆‑NH₂‑3'， NH₂‑DNA2片段序列为5'‑NH₂‑(CH₂)₆‑GTT TCA AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CTA ATT GGA GTC ACC CCA ACC TGC CCT ACC ACG GAC T‑(CH₂)₆‑NH₂‑3'；其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：a、合成Eu(III)‑MWCNTs纳米材料；b、制备电化学发光适配体传感器工作电极；c、制作电化学发光适配体传感器工作曲线；其中，步骤a合成Eu(III)‑MWCNTs纳米材料的具体步骤如下：① 稀土配合物Eu(TTA)₃的合成：将含有1.0 mol/L KOH的乙醇溶液和五水硝酸铕混合，然后加入15 mL的乙醇和2‑噻吩甲酰三氟丙酮 (与五水硝酸铕的物质的量之比3:1)，混合溶液在搅拌下加热至60 ℃反应6 h，冷却至室温后加水继续搅拌30 min，得到的固体用乙醇重结晶，经空气中干燥后放于五氧化二磷干燥器中干燥24 h即得到白色的稀土配合物Eu(TTA)₃； ② Eu(III)‑MWCNTs的合成：将羧基化的多壁碳纳米管、无水二氯甲烷(DCM)和草酰氯（体积比为40:1）混合后在室温下搅拌12 h，通过减压蒸馏去除DCM后得到酰氯功能化的MWCNTs并真空干燥2 h，将上述得到的酰氯功能化的MWCNTs重新分散在20 mL DCM中，超声10 min，然后加入含有6,6‑二氨基‑2,2‑联吡啶(与羧基化的多壁碳纳米管的质量之比为3:1)的10mL DCM，混合物在室温下搅拌24 h，过滤，并用15 mL的DCM冲洗3次，真空干燥后得到稀土配合物修饰的多壁碳纳米管，称取稀土配合物修饰的多壁碳纳米管，上述步骤①制备的Eu(TAA)₃(质量之比为1:2)和10 mL DCM混合，在室温下搅拌28 h后过滤，用150 mL DCM洗涤，真空干燥后得到Eu(III)‑MWCNTs；步骤b制备电化学发光适配体传感器工作电极的具体步骤如下：① 将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁；② 配制浓度为1 mg/mL的金掺杂的石墨烯溶液，然后将金掺杂的石墨烯溶液滴到电极上，室温晾干；③ 将捕获探针与凝血酶适配体混合溶液滴到电极表面，4 ℃ 孵化12 h；④ 再在电极表面修饰2 mmol/L的MCH溶液以消除电极的非特异性活性位点，用pH为7.4的PBS溶液对电极进行清洗，晾干后，滴上一系列不同浓度的凝血酶（含0.15 U/μL RecJ_f）溶液，放置40 min；⑤ 将NH₂‑DNA1和NH₂‑DNA2的混合溶液修饰到电极上，放置1h；⑥ EDC和NHS (50 mmol/L) 加入到1.5 mg/mL Eu(III)‑MWCNTs中得到混合溶液并将其滴到电极上，放置2 h，即得到电化学发光适配体传感器的工作电极；步骤c制作电化学发光适配体传感器工作曲线的具体步骤如下：① 将参比电极—Ag/AgCl电极、对电极—铂丝电极和上述制备的工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增光的高压设置为800 V，扫描电压设置为‑2.0～0 V； ② pH 7.4的PBS缓冲溶液(含0.10 mol/L的K₂S₂O₈)作为底液，通过电化学发光法检测不同浓度的凝血酶产生的电化学发光信号强度；根据所得的电化学发光强度与凝血酶浓度的线性关系，绘制工作曲线。