[发明专利]一种生产人源胶原蛋白Ⅱ型的方法

摘要

本文发明公开了一种生产重组人源胶原蛋白Ⅱ型的方法，属于基因工程的技术领域。其特征在于：利用杆状病毒多基因表达系统，用转化了该杆状病毒多基因表达系统的细菌感染昆虫细胞，产生一种表达多基因的杆状病毒，将病毒液侵染昆虫细胞或注射入家蚕幼虫体内，由此生产重组人源胶原蛋白Ⅱ型全长蛋白，其蛋白结构为3条具有(G-X-Y)_n重复序列的肽链形成三股螺旋结构，保持天然胶原蛋白Ⅱ型的构象，具有天然胶原蛋白Ⅱ型的活性。采用本发明的方法，能表达多个基因，利于生产胶原蛋白Ⅱ型全长蛋白；本发明工艺方法简单，操作简便，工艺路线短。

主权项

一种生产重组人源胶原蛋白II型的方法，所述方法包括下述步骤：(1)获得SEQ ID No.1所示的人源胶原蛋白II型α1链全长基因，并连接至转移载体pFBDM中构建重组质粒pFBDM‑col II；(2)向步骤(1)构建的重组质粒pFBDM‑col II中插入IRES序列和荧光蛋白编码序列；(3)获得SEQ ID No.2所示的人源脯氨酸羟化酶α亚基和SEQ ID No.3所示的人源脯氨酸羟化酶β亚基序列，共同符合阅读框地连接至转移载体pUCDM，获得重组质粒pUCDM‑P4Hα‑P4Hβ；(4)将步骤(2)构建的重组质粒和步骤(3)构建的重组质粒pUCDM‑P4Hα‑P4Hβ通过转座的方式导入asd营养缺陷型宿主大肠杆菌SW106感受态细胞，构建生产人源胶原蛋白的重组基因病毒DNA的重组大肠杆菌SW106细胞；(5)将步骤(4)制备的重组大肠杆菌SW106细胞感染昆虫细胞产生杆状病毒，再利用所述杆状病毒上清液感染昆虫细胞，进行重组蛋白的表达；并且(6)收集感染的昆虫细胞的培养液上清，亲和纯化得到所述重组人源胶原蛋白II型，并进行测活；其中步骤(5)的昆虫细胞为家蚕细胞BmN或SF9细胞。