[发明专利]一种简单、快速提取和纯化Taq-DNA聚合酶的方法

摘要

本发明提供了一种简单、快速提取和纯化Taq-DNA聚合酶的方法。该方法充分利用了乙醇对蛋白质的沉淀作用和核酸酶活性，简化了Taq-DNA聚合酶提取和纯化的步骤，缩短了操作时间和节约了成本。与已知的提取方法相比，我们的方法具有简单、快速和成本低的特点，完全去除了Taq-DNA聚合酶提取产物中的核酸污染。提取的Taq-DNA聚合酶可以应用于各种PCR反应中，包括实时定量PCR反应。

主权项

 一种简单、快速提取和纯化Taq‑DNA聚合酶的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：（1）接种：挑取含Taq‑DNA聚合酶E.coli 单克隆，接种到3ml的含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于摇床，37℃，270 r/min，培养5‑8 小时；（2）扩大培养：将步骤（1）中培养好细菌液转接到500 ml 含氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于摇床，37℃，270 r/min培养5‑6小时至细菌OD₆₀₀ 值达到0.6‑0.8；（3）诱导Taq‑DNA酶表达：加入异丙基硫代半乳糖苷诱导剂，置于摇床，37℃, 270 r/min，培养12小时；（4）收集菌体：将步骤（3）培养得到的菌液分装于50 ml离心管，8000 rpm 离心10min，弃上清，加入25ml Buffer A重悬菌液，8000 rpm 离心10min，弃上清；（5）裂解菌体：加入25 ml Buffer A重悬菌液，采用液氮和75 ^oC水浴中交替冻融两次，加入100mg溶菌酶，室温下放置10~20分钟，直至溶液变得粘稠，而后在溶液中加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟至1mM；（6）粗提：加入25 ml Buffer B，75℃水浴加热30 min后8000 rpm 离心15min，取上清；（7）纯化：在上清液中先后加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟，MgCl₂，DNase I以及RNase A处理5 min，75℃水浴加热30 min，8000 rpm 4℃ 离心10 mim，取上清，加入冰浴后的乙醇，终浓度为15%‑99%，颠倒混匀，16000 g 4℃离心15 min，弃上清，沉淀溶于12.5mL Storage buffer，‑20℃储存备用。