[发明专利]一种获得邳半夏转基因愈伤组织的遗传转化方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体为一种获得邳半夏转基因愈伤组织的遗传方法。本发明包括邳半夏愈伤组织的诱导培养，带有GUS基因的植物高效表达载体转入根癌农杆菌，农杆菌遗传转化愈伤，转化受体材料的继代增殖培养及抗性胚性愈伤组织的筛选，抗性愈伤组织的继代增殖培养，PCR检测和GUS基因的检测等。本方法在邳半夏愈伤组织中表达GUS基因，成功地得到邳半夏愈伤组织遗传转化方法。本发明方法获得的邳半夏转基因愈伤组织可在邳半夏基因工程，细胞工程，代谢工程及邳半夏遗传转化体系的建立中具有广泛应用。

主权项

一种获得邳半夏转基因愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于利用邳半夏叶柄作为外植体诱导愈伤组织，并经过培养获得愈伤，用根癌农杆菌介导，将带有GUS基因的pCAMBIA1301质粒导入邳半夏愈伤组织，PCR检测外缘潮霉素磷酸转移酶基因的整合情况，用组织化学方法检测GUS基因在组织中的表达情况，获得邳半夏的转基因愈伤组织；具体步骤为：  （1）邳半夏愈伤组织的诱导培养：选择幼嫩的叶柄为愈伤组织诱导用外植体，在愈伤组织诱导培养基上进行培养，在叶柄被切开的部位逐渐产生白色的愈伤组织，叶柄不断膨大；上述愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础，再添加激素6‑BA和NAA而组成；  （2）邳半夏愈伤组织的诱导培养：将叶柄诱导的白色愈伤转接入胚性愈伤诱导培养基上，获得致密的、硬度增加的胚性愈伤组织；该胚性愈伤诱导培养基是以MS培养基为基础，再添加激素2，4‑D、6‑BA和KT而组成；  （3）遗传转化：利用根癌农杆菌介导法，将含GUS基因的植物表达载体pCAMBIA1301转化根癌农杆菌，以邳半夏胚性愈伤组织为受体进行遗传转化；  （4）抗性胚性愈伤组织的脱菌、筛选和增殖培养：经过遗传转化，然后在恢复培养基上进行脱菌培养，在筛选培养基上进行筛选培养，获得具有潮霉素抗性的愈伤组织；将抗性愈伤组织接入胚性愈伤组织继代培养基进行增殖培养，增加抗性愈伤组织的数量；  （5）PCR检测和GUS组织化学染色方法检测转基因愈伤：PCR法扩增转基因愈伤总DNA获得pCAMBIA1301质粒上带有的潮霉素磷酸转移酶基因；GUS组织化学染色，将愈伤组织浸入配制好的GUS染色液中，37^oC染色过夜，愈伤组织中的蓝色为报告基因GUS组织化学染色，表明外源基因已经整合到受体细胞的染色体中并表达。