[发明专利]一种基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法

摘要

本发明公开了一种基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法，其特征在于该百合脱毒方法的步骤如下1）将无病虫害的百合鳞片通过组培特异性诱导产生胚性愈伤组织；2）将胚性愈伤组织诱导成苗并进行热处理；3）剥离茎尖并对其进行特异性诱导产生胚性愈伤组织；4）再次将胚性愈伤组织诱导成苗并扩繁；5）对步骤4）中的组培苗进行病毒检测，检测合格即为百合脱毒种苗。本发明的百合脱毒方法通过两次胚性愈伤诱导解决了所需脱毒材料多、脱毒苗抗性差及脱毒不彻底的问题，能有效克服百合种植次数较多造成的种性退化问题，具有脱毒效率高、方法操作简单、生产设备要求低的特点，能够满足规模化生产的需要。

主权项

一种基于胚性愈伤特异诱导的百合脱毒方法，其特征在于：该百合脱毒方法的步骤如下：1）将无病虫害的百合鳞片通过组培特异性诱导产生胚性愈伤组织；2）将胚性愈伤组织诱导成苗并进行热处理；3）剥离茎尖并对其进行特异性诱导产生胚性愈伤组织；4）再次将胚性愈伤组织诱导成苗并扩繁；5）对步骤4）中的组培苗进行病毒检测，检测合格即为百合脱毒种苗；该百合脱毒方法的详细步骤如下：1）将无病虫害的百合鳞片通过组培特异性诱导产生胚性愈伤组织：选取完好且无病斑的百合鳞片，用清水冲洗干净后，接着用中性肥皂水浸泡15‑20min，再用流水冲洗0.5‑2小时；用75%的酒精浸泡30‑40s后放入0.1%‑0.2%的升汞中10‑15分钟，再用无菌水冲洗4‑6次，然后把鳞片切成0.5‑1.0cm2的方块放入诱导胚性愈伤的培养基内进行暗培养，20‑35天后转接1次，再继续培养20‑35天后形成胚性愈伤组织；2）将胚性愈伤组织诱导成苗并进行热处理：把诱导成功的胚性愈伤组织从外部转接到诱导不定芽培养基上，光照条件下培养25‑35天至小芽长至0.5cm以上，然后把诱导成芽的组培瓶移到光照培养箱内暗培养15‑20天，光照培养箱内的温度控制在25℃‑38℃进行变温热处理；3）剥离茎尖并对其进行特异性诱导产生胚性愈伤组织：把上述经过热处理的百合小苗，剥取0.5‑0.8cm大小的茎尖生长点接种到茎尖诱导愈伤培养基上，在25‑30℃条件下暗培养2‑3个月，使其诱导出胚性愈伤组织，在培养期间每隔一定时间转接一次；4）再次将胚性愈伤组织诱导成苗并扩繁：把愈伤组织转接到诱导成芽的培养基上，暗培养1‑2个月后继代扩繁一次，3‑4个月后即得到直径0.3‑1.5cm的百合小鳞茎；5）随机抽取步骤4）中的百合小鳞茎，进行病毒检测：对步骤4）中完成脱毒处理的百合小鳞茎随机抽取10%‑20%，进行RT‑PCR反转录病毒检测，经检测确认不带百合无症病毒、黄瓜花叶病和百合斑驳病毒，即为百合脱毒种苗；步骤1）中用于诱导百合鳞片产生胚性愈伤组织的培养基为：MS+2mg/L6‑BA+1mg/L2，4‑D+6%蔗糖+6.5g/L琼脂，该培养基的pH=5.8；步骤2）中将胚性愈伤组织诱导成苗的培养基为：1/2MS+6%糖+0.7mg/L6‑BA+0.2mg/L NAA；步骤2）中的热处理时的温度控制在33℃‑38℃高温处理8h‑12h、然后25℃‑28℃低温处理16h‑12h交替进行；步骤3）中用于诱导茎尖产生胚性愈伤组织的培养基为：MS+2.5mg/L Picloram +0.5mg/L NAA+6%蔗糖+6.5g/L琼脂，该培养基的pH=5.8；步骤4）中将胚性愈伤组织诱导成苗的培养基为：1/2MS+6%糖+0.7mg/L6‑BA+0.2mg/L NAA。