[发明专利]一种长期体外培养和扩增肝细胞的方法及其应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，本发明提供了一种长期体外培养和扩增肝细胞的方法，该方法在体外将成熟肝实质细胞诱导成为具有无限增殖能力的肝细胞，本发明制备得到的肝细胞可用于化合物和药物的毒理学和药理学评价、肝炎病毒的研究和诊疗、肝细胞移植治疗、生物人工肝的制备等应用。

主权项

1.一种体外培养和扩增肝细胞的方法，其特征在于，该方法在体外将肝实质细胞诱导成为具有无限增殖能力的肝细胞，包括以下步骤：A、采用胶原蛋白I或Matrigel基质胶对培养支持物的预包被；B、将肝实质细胞传入步骤A提供的经预包被的培养支持物上，在肝细胞增殖培养基中进行培养和扩增；所述的肝细胞增殖培养基是由基础培养基和添加的营养成份组成，所述的基础培养基为WilliamsE或DMEM/F12培养基；所述的添加的营养成分为20‑50ng/mL的人成纤维细胞生长因子‑2、1‑3μM的Wnt信号通路的小分子激动剂CHIR98014、0.5‑1μM的Rho相关蛋白激酶抑制剂thiazovivin、体积百分含量为1％的胰岛素‑转铁蛋白‑亚硒酸钠混合补充液、0.1mM的β‑巯基乙醇、体积百分含量为1％的非必须氨基酸以及体积百分含量为1％的GlutaMAX；C、步骤B获得的增殖状态的肝细胞，转入肝细胞分化培养基中培养获得肝实质细胞；所述的肝细胞分化培养基由基础培养基和添加物组成，所述的基础培养基为WilliamsE或DMEM/F12培养基；所述的添加物为体积百分含量为1％的胰岛素‑转铁蛋白‑亚硒酸钠混合补充液、体积百分含量为1％的GlutaMAX、0.1μM的地塞米松、10ng/mL的人抑瘤素‑M以及非必须氨基酸和β‑巯基乙醇；D、步骤C获得的肝细胞的标志物鉴定。