[发明专利]一种适合微量樱桃叶片DNA高效提取方法

摘要

本发明公开了一种适合微量樱桃叶片DNA高效提取方法，属于分子生物学技术领域，该方法为：取微量经过变色硅胶充分干燥的樱桃叶片，置于2ml离心管中，用末端经过打磨的直径0.6cm的玻璃棒快速捣碎叶片呈粉末状，然后通过缓冲液洗涤、裂解、抽提、沉淀和检测等步骤，最后得到高浓度和纯度的DNA。本发明取代了传统DNA提取方法中普遍使用的液氮研磨，通过此方法在不使用液氮的情况下依然能够得到高质量的DNA，而且还可以防止材料在液氮研磨过程中的褐化。该方法操作简单，实用方便，效率高，尤其是针对微量珍贵材料的DNA提取具有重要作用。

主权项

一种适合微量樱桃叶片DNA高效提取方法，其特征在于，包括以下步骤：1)材料准备：采集新鲜樱桃幼叶片置于封口袋中，按照1∶20‑1∶50的比例加入变色硅胶，并充分混匀，直到叶片完全干燥；2)取充分干燥的樱桃叶片0.01‑0.03g置于2ml离心管中，用直径0.6cm前段打磨成平滑卵头状的玻璃棒快速捣碎干燥叶片至呈粉末状；3)加入1ml缓冲液1和10μlβ‑巯基乙醇，充分混合后在在常温下5000rpm离心3min，弃上清，收集沉淀；4)在沉淀中加入1ml65℃预热的3％的CTAB缓冲液和10μlβ‑巯基乙醇，65℃水浴1h，期间每隔5‑10min颠倒离心管以使液体混匀，然后26℃下12500rpm离心10min；5)取上清液转入新的2.0ml的离心管中，加入等体积的氯仿，轻摇萃取，在5℃下12500rpm离心10min；6)上清液转入新的2.0ml离心管中，重复步骤5)；7)取上清液约600μl转入新的1.5ml离心管中，加入2倍体积经‑20℃预冷的无水乙醇和1/10体积的3mol/L的醋酸钠，颠倒混匀‑20放置30min，11000rpm离心15min，弃上清，收集沉淀；8)在DNA沉淀中加入75％乙醇800μl，轻摇并放置5min，倒掉乙醇，如此清洗两次，再用无水乙醇清洗一次，置于通风处过夜吹干；9)DNA沉淀用50μl TE溶解，然后加入1μl10ng/μl的RNase A，常温过夜后置于‑20℃冰箱保存备用；10)取2μl溶解的DNA溶液，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，并在Eppendorf Biophotomete型核酸蛋白质分析仪上检测260nm、280nm处的吸收值和DNA的浓度，并根据OD 260/OD280值来判断DNA的纯度。