[发明专利]一种测定水产品中的孔雀石绿酶联免疫吸附法

摘要

本发明涉及一种测定水产品及水样中孔雀石绿(MG)的间接竞争酶联免疫吸附分析法。对孔雀石绿分子进行修饰，使其与载体蛋白交联，得到免疫原和包被抗原，经过多次免疫动物制得抗孔雀石绿的多克隆抗体。在优化的实验条件下，IC₅₀值(标准曲线中吸光度抑制至最大吸光度值的50％时所对应的待测物浓度)为0.9~2.6ug/L，检出限为0.02~0.10ug/L。孔雀石绿在水样及水产品中的回收率为76.2~95.0％，与无色孔雀石绿的交叉反应率为95.25%。本发明包括包被液、洗涤液、终止液、封闭液以及底物溶液的配制，抗体固定，免疫反应，检测信号的获得等步骤。结合竞争酶联免疫吸附法的特点对水产品中的孔雀石绿含量进行检测，灵敏度高、干扰小、简便、快速、操作安全、特异性强，测试成本低。

主权项

一种水产品中孔雀石绿含量的检测方法，其特征是，包括以下步骤：(1)溶液的配制a.包被液的配制：将碳酸钠、碳酸氢钠配制成pH7.0‑8.0的溶液，低温保存；b.洗涤液的配制：将氯化钠、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾及吐温20配制成pH7‑8的溶液，低温保存；c.终止液的配制：配制10‑15％的浓硫酸；d.封闭液的配制：将氯化钠、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、吐温20及牛血清白蛋白配制成pH7‑8的溶液，低温保存；e.底物溶液的配制：将磷酸氢二钠、柠檬酸、H₂O₂及四甲基联苯胺配制成溶液；(2)抗体固定将孔雀石绿多克隆抗体用包被液稀释，以每孔100μL加入酶标板中，同时设立正常血清稀释液的阳性对照，低温过夜保存；将孔中液体倒尽，加入洗涤液，保留3min，再倒尽，如此重复洗涤多次；每孔中添加100μL封闭液，37℃，保留1h；将孔中液体倒尽，加入洗涤液，保留3min，再倒尽，如此重复洗涤多次；(3)免疫反应用封闭液稀释待测样品溶液后加入酶标板孔中，100μL/孔，37℃，保留1‑2h，孔中液体倒掉，加入洗涤液，保留3min，倒尽，如此重复洗涤多次；用封闭液稀释酶标孔雀石绿溶液后加入孔中，100μL/孔，37℃，保留1‑2h，孔中液体倒掉，加入洗涤液，保留3min，倒尽，如此重复洗涤多次；加入底物溶液，100μL/孔，避光，37℃，10‑15min；加入终止液终止反应，100μL/孔；(4)检测信号的获得a.用酶标仪检测酶标板孔中的液体OD值，根据OD值判断样品中孔雀石绿的含量，根据孔雀石绿含量的标准曲线可计算出样品中孔雀石绿的含量大小；b.按照权利要求1所述的水产品中孔雀石绿含量的检测方法，其特征是：所述重复洗涤的次数为三次；c.按照权利要求1所述的水产品中孔雀石绿含量的检测方法，其特征是：所述低温为4℃。