[发明专利]一种适用于反刍动物骨骼肌全蛋白制备及双向电泳技术

摘要

本发明涉及一种反刍动物骨骼肌的总蛋白质提取及双向电泳方法，属于生物技术领域。是针对反刍动物，特别是羊的骨骼肌中全蛋白采用双向电泳技术分离和分析，采用本技术方案对羊骨骼肌进行的实验取得了较优效果。经过反复实验证明，采用双向电泳方法对其进行分离，分离所得蛋白点多，重复性好、图谱清晰，无横纵纹现象，蛋白点规则，重复性好，是一套适用于反刍动物骨骼肌总蛋白组分析的双向电泳方法。

主权项

一种反刍动物骨骼肌蛋白双向电泳方法，其特征在于按下列步骤进行：1)采集反刍动物骨骼肌样品，用液氮罐装运回，在实验室‑80℃以下保存备用；2)称取1g反刍动物骨骼肌解冻后放入研钵中，加入液氮研磨，直到研磨成粉末状，转入预冷‑20℃的15ml离心管；3)加入10倍体积预冷的蛋白质裂解液，充分混合后，辅以超声破碎10s；其中蛋白质裂解液为7M尿素、2M硫脲、40mM Tris、质量体积比4％3‑[(3‑胆固醇氨丙基)二甲基氨基]‑1‑丙磺酸CHAPS、65mM DTT、1mM蛋白酶抑制剂以及2％IPG buffer；4)4℃孵育2h后于10000g、低温4℃离心机中离心1h；5)离心后漂去上层脂质，吸取适量清液分装备用，若脂肪过多可吸取上清液进行二次离心，以提高蛋白质的提取率；6)蛋白质定量：采用Bradford法测定其蛋白浓度；7)第一向等电聚焦电泳：按上样量450μg，上样体积450μL，对已定量好的蛋白样品进行稀释，上样水化液同步骤3)中的裂解液，将样品加入固相pH梯度IPG胶条聚焦盘内后，再将pH 4‑7，pH 3‑10，24cm的IPG胶条胶面向下放入盘中，除去胶面与样品液间的气泡，用2ml矿物油/条，覆盖胶条，进行等电聚焦电泳；所述的等电聚焦电泳中采用渐进式升压；8)胶条平衡：将聚焦好后的固相pH梯度IPG胶条进行平衡I、II，每次平衡时间为15min，平衡缓冲液配制如下：胶条平衡缓冲液母液：6M尿素，2％(w/v)十二烷基磺酸钠SDS，75mM pH8.8的Tris‑HCl，29.3％的87％甘油，溶剂为水；胶条平衡缓冲液I：每10ml胶条平衡缓冲液母液加入0.1g DTT；胶条平衡缓冲液II：每10ml胶条平衡缓冲液母液加入0.25g碘乙酰胺；9)第二向SDS‑PAGE电泳：将平衡好的胶条置于胶浓度为质量体积比12％的SDS‑PAGE胶上，用质量体积比0.5％、含有质量体积比0.002％溴酚蓝的低熔点琼脂糖封胶液封住顶部，按如下参数进行电泳：12℃恒温下，最大电流电压下，先用1w/胶，1.5h；再用8.5w/胶至电泳结束；10)染色方法：采用考马斯亮蓝法和银染法进行染色；所述的反刍动物为羊。