[发明专利]用于细叶百合遗传转化和种球快繁的体细胞胚离体再生方法

摘要

本发明提供一种用于细叶百合遗传转化和种球快繁的体细胞胚离体再生的方法，其工艺步骤包括取细叶百合无菌苗叶片，接种于MS+BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1中培养35天，获得非胚性愈伤组织。随后将其转于MS+BA0.5mg·L-1+NAA1.0mg·L-1中培养45天，获得胚性愈伤组织后转入MS+NAA0.5mg·L-1中，调整胚性比例，而后依次交替使用这两种培养基，可获得胚性比例高、萌发率低的胚性愈伤组织培养物。最后转于MS中，每1cm3胚性愈伤组织培养物可形成超过21个体细胞胚。本发明以无菌苗为外植体，降低对百合原种的消耗；胚性愈伤组织诱导率高，保存效果好，肉眼可辨别，是遗传转化的良好受体；较以往方法，本发明建立的体细胞胚再生体系在愈伤组织诱导率和成苗系数方面分别提高了40%和3-4倍。

主权项

一种用于细叶百合遗传转化和种球快繁的体细胞胚离体再生方法，其特征是工艺步骤为：⑴ 外植体脱分化阶段将叶片切为长0.5 cm小段，正面向上、平铺接种于脱分化培养基MS+BA 1.0 mg·L‑1+NAA 0.5 mg·L‑1中，光培养；该培养基中含有蔗糖30 g·L‑1，琼脂（条）7 g·L‑1 ，pH 5.8，121℃高压灭菌20 分钟。培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80‑90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36 μmol·m‑2·s‑1；接种15天时，叶片、叶柄表层皱缩并形成细微的嫩黄色颗粒，后形成愈伤化。接种35天时，形成黄绿色、晶莹度大、湿度高、表面平滑的非胚性愈伤组织；⑵ 胚性细胞转化阶段在脱分化培养基中培养第45天，将步骤1中外植体脱分化获得的非胚性愈伤组织切为0.5 cm3小块，转接于胚性愈伤组织诱导培养基MS+BA 0.5 mg·L‑1+NAA 1.0 mg·L‑1（即BA/NAA为1/2）中，使非胚性愈伤组织插入培养基内2‑3 mm，光培养。培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80‑90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36 μmol·m‑2·s‑1。接种30天，在黄绿色非胚性愈伤组织表面形成亮黄色、颗粒性明显的胚性愈伤组织；⑶ 胚性比例和颗粒性调整阶段经步骤2培养45天，去除黄绿色非胚性愈伤组织部分，将亮黄色的胚性愈伤组织切为1 cm3小块，转接于胚性愈伤组织调整培养基MS+NAA 0.5 mg·L‑1中，光培养。培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80‑90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36 μmol·m‑2·s‑1。相同培养基继代培养1次后可获得胚性比例高于90%、萌发率低于5%、颗粒性良好的胚性愈伤组织；⑷ 球形胚诱导阶段选择步骤3中获得的胚性愈伤组织，去除绿色非胚性愈伤组织和萌发的芽，依次交替使用胚性愈伤组织诱导培养基MS+BA+NAA和胚性比例调整培养基MS+NAA，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80‑90%，每45天更换一次培养基，交替使用2次，可获得胚性比例高达100%、萌发率为0的良好胚性愈伤组织培养物，其中1 cm3愈伤组织培养物含有20个以上的球形胚；⑸ 体细胞胚萌发和成苗阶段将步骤4中含有球形胚的胚性愈伤组织培养物转于MS基本培养基中，培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80‑90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36 μmol·m‑2·s‑1。15‑20天后，球形胚萌发，依次经历心形胚、盾形胚及子叶胚阶段萌发形成成熟体细胞胚，1 cm3胚性愈伤组织培养物可形成超过21个体细胞胚。2. 根据权利要求1所述的用于细叶百合遗传转化和种球快繁的体细胞胚离体再生方法，其特征是：脱分化培养基为MS+BA 1.0 mg·L‑1+NAA 0.5 mg·L‑1。3. 根据权利要求1所述的用于细叶百合遗传转化和种球快繁的体细胞胚离体再生方法，其特征是：胚性愈伤组织诱导培养基为MS+BA 0.5 mg·L‑1+NAA 1.0 mg·L‑1。4. 根据权利要求1所述的用于细叶百合遗传转化和种球快繁的体细胞胚离体再生方法，其特征是：胚性愈伤组织调整培养基为MS+NAA 0.5 mg·L‑1。