[发明专利]一种检测人血清中痕量免疫球蛋白G浓度的方法

摘要

本发明公开了一种检测人血清中痕量免疫球蛋白G浓度的方法。以羊抗人免疫球蛋白G抗体标记的异硫菁酸荧光素作为能量转移的给体，纳米金作为受体，构成性能稳定的能量转移体系，羊抗人免疫球蛋白G抗体标记的异硫菁酸荧光素将能量传递给纳米金，使其荧光发生猝灭。而免疫球蛋白G加入后却使异硫菁酸荧光素的荧光恢复，且其荧光恢复值与免疫球蛋白G的浓度在4.0~220.0纳克/毫升范围内呈良好的线性关系，从而建立检测人免疫球蛋白G的新方法。本发明克服了已有技术在检测时存在灵敏度低、操作繁琐等缺点，对于人血清中免疫球蛋白G的检测更加方便快速。

主权项

一种检测人血清中痕量免疫球蛋白G浓度的方法，其特征在于具体步骤为：(1)纳米金溶液的制备：将5毫升5毫摩尔/升氯金酸加入到100毫升亚沸水中，在不断搅拌下加热至沸，然后快速加入5毫升质量体积浓度为0.1%的柠檬酸溶液，保持沸腾10分钟，溶液的颜色逐渐变成酒红色，停止加热，在10000 转/分钟转速下离心10 分钟，除去过量的柠檬酸，即制得浓度为50纳摩尔/升的纳米金溶液，在4℃的条件下保存，备用；(2)羊抗人免疫球蛋白G抗体标记异硫菁酸荧光素溶液的制备：将20毫升1.0×10^‑5摩尔/升异硫菁酸荧光素，100微升20毫克/毫升的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和100微升10毫克/毫升的N‑羟基丁二酰亚胺在室温下混合搅拌0.5小时，再加入100微升1毫克/毫升羊抗人免疫球蛋白G抗体，在室温下孵化2小时，最后在10000转/分钟的转速下离心30分钟，除去多余的抗体，即制得羊抗人免疫球蛋白G抗体标记异硫菁酸荧光素溶液，在4 ℃的条件下保存，备用；(3)配制溶液：分别将50微升步骤(2)制备的羊抗人免疫球蛋白G抗体标记异硫菁酸荧光素溶液，800微升步骤(1)制备的纳米金溶液和0、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、50.0、70.0、110.0微升1.0×10^‑5 克/毫升的免疫球蛋白G加入到9支5毫升色管中，用pH＝7.4的缓冲溶液定容至刻度，反应10分钟；所述pH＝7.4的缓冲溶液含有0.05摩尔/升的磷酸氢二钠和0.05摩尔/升的磷酸二氢钠；(4)工作曲线的绘制：将步骤(3)制得的溶液分别用RF‑5301 PC荧光光度计进行荧光强度检测，激发波长为480纳米，激发和发射狭缝宽度均为5纳米；根据测量结果，免疫球蛋白G的浓度c在4.0~220 纳克/毫升范围内与荧光恢复值ΔI_F呈良好的线性关系，其线性回归方程为：ΔI_F= 9.52+1.68c，线性相关系数r = 0.9987；(5)人血清中免疫球蛋白G的检测：a.将待测人血清样品用50毫摩尔/升的磷酸盐缓冲液稀释1000倍作为待测溶液；b.分别将50微升步骤(2)制备的羊抗人免疫球蛋白G抗体标记异硫菁酸荧光素溶液，800微升步骤(1)制备的纳米金溶液和步骤(5)第a步制备的待测溶液加入5毫升色管中，用pH＝7.4的缓冲溶液定容至刻度，反应10分钟；用RF‑5301 PC荧光光度计在激发波长为480纳米，激发和发射狭缝宽度均为5纳米的条件下进行荧光强度检测， 测得荧光恢复量ΔI_F，根据步骤(4)所得的线性回归方程，即算出免疫球蛋白G的浓度c；所述pH＝7.4的缓冲溶液含有0.05摩尔/升的磷酸氢二钠和0.05摩尔/升的磷酸二氢钠。