[发明专利]一种将外源基因转入菊花或近缘种进行瞬时表达的方法

摘要

本发明提供一种通过农杆菌注射渗透法将外源基因转入菊花或近缘种进行瞬时表达的方法，该外源基因为GUS基因，由携带35s启动子及终止子，小于10kb的过量表达载体质粒携带。主要步骤包括（1）植株的获得（2）植物表达载体pORER1‑2×35s:gus的构建（3）侵染液制备（4）菊花叶片的制备（5）叶片转化（6）叶片转化后培养（7）阳性转化叶片检测。本发明通过选择合适的外植体、以农杆菌菌株作为易感菌株，通过利福平和卡那霉素选择侵染菌体；同时，以P19与农杆菌混合培养制成侵染液，P19能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量，并且合理优化共培养条件，使该方法转化时间缩短至45天左右，转化效率达到60%以上。本发明方法为更有效地筛选和分析菊花基因功能、蛋白质定位及进一步获得稳定转化子提供了可能。

主权项

一种将外源基因转入菊花进行瞬时表达的方法，其特征在于：该方法通过农杆菌注射渗透法将含有GUS基因的瞬时表达载体转入菊花‘优香’叶肉细胞中，经培养，使GUS基因在叶片中瞬时表达；其中，瞬时表达载体为携带35s启动子及终止子，小于10kb的过量表达载体质粒；具体方法包括如下步骤：（1）植株的获得：采用生根后30d‑50d，有完全展开叶10‑14片的菊花‘优香’扦插苗；选取扦插苗中上部完全展开叶进行标记，以备注射；（2）植物表达载体pORE R1‑2×35s:gus的构建：设计引物分别为上游引物2×35S‑Sac‑F :SEQ ID NO. 2，下游引物2×35S‑Nhe‑R: SEQ ID NO. 3，以pCAMBIA1301质粒DNA为模板，用高保真酶，进行PCR扩增反应，PCR产物回收；PCR产物与Sac Ⅱ和Nhe I双酶切后的pORE R1载体连接，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，植物表达载体pORE R1‑2×35s:gus构建成功；（3）侵染液制备：将pORE R1‑2×35s:gus转入农杆菌EHA105中；挑取单克隆，PCR电泳检测，选取正确构建质粒的单克隆阳性农杆菌转入YEB液体培养基中，过夜轻摇培养16～20h，同时摇菌 P19；把摇好的两种菌液进行常温离心，去上清，收集菌体，分别用侵染缓冲液重悬；将含有正确构建质粒的阳性农杆菌菌液与P19等体积混合，然后将混合菌液常温轻摇培养至少3小时；（4）菊花叶片的制备：于叶片近轴端主叶脉中部两侧无叶脉处点刻伤或十字刻伤，伤口只需透过叶表皮，不可穿透叶片；（5）叶片转化：以去除针头的注射器吸取步骤（3）制备的侵染液，出水口对准刻伤处，缓推注射器活塞，同时手指轻压刻伤处对应的叶片远轴端位置，以使侵染液渗透入叶片背面，重复数次以使侵染液尽可能蔓延至整个叶片，标记下注射的叶片对应区域；（6）叶片转化后培养：将转化后的扦插苗用保鲜膜封闭保湿，置于黑暗中培养1.5‑2d，然后再转入光下培养 2‑3 d，获得转化后的活体植株；（7）阳性转化叶片检测：以X‑Gluc染色反应液浸没标记叶，过夜染色后脱色至透明状后，观察叶片GUS染色状况；设计GUS基因引物：上游引物GUS‑RT‑F: SEQ ID NO. 4，下游引物GUS‑RT‑R: SEQ ID NO. 5，选取标记叶片提取RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板PCR扩增检测阳性转化叶片中GUS的表达。