[发明专利]PttKN1基因在碎米荠中的遗传转化方法

摘要

本发明涉及一种PttKN1基因在碎米荠中的遗传转化方法，具体包括以下步骤：(1)准备植物材料与载体；(2)采用农杆菌介导的花絮浸染法对碎米荠的转化；(3)抗性植株筛选和表型观察；(4)RT-PCR鉴定；(5)针对结果进行分析统计。本发明利用农杆菌介导的花序浸染法对碎米荠进行了遗传转化。经100mg/L卡那霉素筛选后，抗性植株表现出子叶形态改变、生长点异常、杯状叶、缺刻叶和扁茎等形态改变。RT-PCR检测表明，抗性植株的表型改变可能是由于PttKN1基因的异源表达所引起的。这为进一步研究该基因在复叶的形成和复叶植物发育中的功能奠定了重要基础。

主权项

一种PttKN1基因在碎米荠中的遗传转化方法，其特征在于：具体包括以下步骤：(1)准备植物材料与载体：将春化过的碎米荠种子种于蛭石∶泥炭土∶珍珠岩按照1∶1∶1的混合基质中，覆保鲜膜，两天后光照，三天后揭膜；选取生长健壮，有较多未开放花蕾的碎米荠植株备用；培养条件：相对湿度80％，恒温20～24℃，光照强度80～200μmol/M²S，16h光照培养；(2)采用农杆菌介导的花絮浸染法对碎米荠的转化：采用花序浸染法对碎米荠进行遗传转化；首先挑取单菌落，接种于YEB+25mg/LKm+75mg/LCb液体培养基中，于27℃、180rpm培养过夜；将菌液倒入无菌带盖离心管内，盖上盖子，用石蜡膜封口，4000rpm于室温下离心10分钟；弃上清，用无菌1/2MS液体培养基(含5mg/L BA或/和0.01％Silwet L‑77)稀释菌体至OD₆₀₀为0.3；在开花期，将未开放花序浸入装有上述液体的1升塑料烧杯中，浸泡5min；然后用黑色塑料袋套住花序保湿，24h后去袋，恢复正常光照培养；生长3～5周以后收种；(3)抗性植株筛选和表型观察：将收取的碎米荠种子先在4℃下春化48h，再分别用70％乙醇浸泡1min，0.1％升汞浸泡8min，无菌蒸馏水冲洗三次；然后接种于含有100mg/L卡那的MS培养基上，于25℃下光照培养；45天左右，将具有卡那霉素抗性的碎米荠植株移栽到蛭石∶泥炭土∶珍珠岩按1∶1∶1的混合基质中，并覆盖塑料薄膜，弱光生长2‑3天后让其在自然条件下生长；对各时期植株的表型仔细观察比较，并用照相；(4)RT‑PCR鉴定：称取0.1g叶片，于液氮中充分冷冻后研磨后移入2ml离心管中，加入1ml Trizol(Invitrogen)，震荡混匀，室温下静置5分钟；再加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15秒，室温下静置2分钟后于4℃，12000g离心15分钟；取上清，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温下静置10分钟后于4℃，12000g离心10分钟；弃上清，加入1ml75％乙醇，轻轻洗涤沉淀后于4℃，7500g离心5分钟；弃上清，室温下吹干，加入20μlDEPC(焦碳酸二乙酯)水溶解沉淀，‑70℃冻存；根据KNOX基因保守区设计引物，P1：5’～GCTGCTCGTCAAGAGTTTGG～3’和P2：5’～AATCTCAGGTAGTTCAGTCTCCC～3’，由Takara公司合成，引物间序列长度为311bp；以Trizol法提取的总RNA为模板，利用One Step RNA PCR Kit进行PCR反应；反应体系为25μl，包括12.5μL2×RT‑PCR Buffer，2μLRNA，P1、P2各1μL(10μmol/L)，0.5μLRT～Taq Mix，8μLRNase Free ddH₂O；将该反应混合物短暂离心至管底，于Mastercycler gradient PCR仪(Eppendorf)上进行反应；反应程序为37℃反转录45min，94℃预变性2min，94℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后72℃保温10min；反应产物用1％琼脂糖(BBI)凝胶(含0.5μg/mlEB)电泳，凝胶成像系统照相；(5)针对结果进行分析统计：抗性植株的筛选：待浸染过的碎米荠成熟后，收取种子；将其接种于含有100mg/L卡那霉素的筛选性培养基上；将在筛选培养基上生长一个月后仍然成活的植株移栽到蛭石∶泥炭土∶珍珠岩(1∶1∶1)的混合基质中，进行形态观察和后续分析，针对抗性植株进行形态观察和RT‑PCR分析。