[发明专利]重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法有效
| 申请号： | 201410098355.9 | 申请日： | 2014-03-18 |
| 公开（公告）号： | CN103882047A | 公开（公告）日： | 2014-06-25 |
| 发明（设计）人： | 杨霞 | 申请（专利权）人： | 太原锦波生物医药科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/12;C12N15/10 |
| 代理公司： | 太原科卫专利事务所(普通合伙) 14100 | 代理人： | 朱源 |
| 地址： | 030045 山西省*** | 国省代码： | 山西;14 |
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| 摘要： | 本发明涉及基因工程领域重组蛋白的制备方法，具体是一种重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其步骤为：①根据人酸性成纤维细胞生长因子haFGF全长序列设计引物克隆得到原始基因片段，并替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的haFGF基因，所述优化的haFGF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；克隆得到分子伴侣PDI的原始基因片段，并替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而得到优化的PDI基因，所述优化的PDI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；②优化的haFGF基因、优化的PDI基因、标签序列以及蛋白酶切位点序列连接后克隆进入载体，构建得到高效表达载体；或是先构建上述部分序列的备用载体，然后将其余序列连接于部分序列上。 | ||
| 搜索关键词： | 重组 酸性 纤维 细胞 生长因子 蛋白 制备 方法 | ||
【主权项】：
重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的制备方法，其特征在于，其步骤为：①根据人酸性成纤维细胞生长因子haFGF全长序列设计引物克隆得到原始基因片段，并替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的haFGF基因，所述优化的haFGF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；克隆得到分子伴侣PDI的原始基因片段，并替换掉其中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而得到优化的PDI基因，所述优化的PDI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；②优化的haFGF基因、优化的PDI基因、标签序列以及蛋白酶切位点序列连接后克隆进入载体，构建得到高效表达载体；或是先构建上述部分序列的备用载体，然后将其余序列连接于部分序列上，构建得到高效表达载体；③高效表达载体转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导重组基因的表达；同时将含有相应蛋白酶的质粒转入Rosseta菌株，一起诱导表达；随后将两种菌株以任意比例混合；④用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；调整pH值，低温振荡使与蛋白酶切位点序列对应的蛋白酶酶切完全，释放出rhaFGF蛋白，得到高浓度的含有重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的溶液；⑤将含有重组人酸性成纤维细胞生长因子蛋白的溶液进行纯化处理，得到高纯度的rhaFGF蛋白，进行SDS‑PAGE分析和含量测定。
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