[发明专利]动物源性制品中莱克多巴胺含量的快速测定方法

摘要

本发明提供了一种快速测定动物源性食品中莱克多巴胺含量的方法，用莱克多巴胺标准储备液配制九种莱克多巴胺标准溶液，分别与抗体溶液等体积混合，干燥孵育，加入到酶标板中，干燥孵育，洗板，拍干，酶标板内加入二抗溶液，反应结束后洗板，拍干；加显色液，干燥孵育，充分显色。加入硫酸终止液，用酶标仪波测定每孔吸光值，绘制系列莱克多巴胺标准液的工作曲线。将待测定纯瘦肉制成样品制备液，处理后，测定每孔吸光值，同时作空白实验；计算待测动物源性食品中莱克多巴胺含量。该快速测定方法能提高灵敏度、节省能源，稳定性、重现性较好，回收率较高，能满足实验室的检测要求。

主权项

1.一种动物源性制品中莱克多巴胺含量的快速测定方法，具体按以下步骤进行：步骤1：称取氯化钠4.0000g、十二水合磷酸氢二钠1.4500g、氯化钾0.1000g和磷酸二氢钾0.1000g，混合，超纯水溶解并定容至500mL，得磷酸盐缓冲液；称取碳酸钠0.3975g和碳酸氢钠0.7425g，混合，超纯水溶解并定容至500mL，得碳酸盐缓冲液；称取一水合柠檬酸2.5514g和十二水合磷酸氢二钠9.1951g，混合，超纯水溶解并定容至500mL，得底物缓冲液；步骤2：称取牛血清白蛋白1g，用步骤1中的磷酸盐缓冲液定容至100mL，得BSA封闭液；取500mL步骤1中的磷酸盐缓冲液，加入250μL吐温-20，得到PBST洗液；称取3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.0100g，溶于2mL二甲基亚砜中，得到TMB底物液；取20.00mL小牛血清、5.00g蔗糖、1.00g牛血清白蛋白和0.01g叠氮化钠，用步骤1中的磷酸盐缓冲液定容至100mL，得抗体稀释液；取5.00g蔗糖和1.00g牛血清白蛋白，用步骤1中的磷酸盐缓冲液定容至100mL，得到二抗稀释液；步骤3：分别取质量百分比浓度为10%的双氧水溶液21μL、步骤1配制的底物缓冲液10mL以及步骤2配制的TMB底物液200μL，混合，得到显色液；称取98g浓硫酸，缓慢倒入200mL水中，此时该溶液会放热，待溶液恢复至常温定容至500mL，得到摩尔体积浓度2mol/L的硫酸终止液；在盛放抗体的塑料容器中预先加满步骤2制得的抗体稀释液，放入37℃恒温箱中干燥孵育90min；甩干容器内液体，得到封闭好的抗体盛放容器；在盛放二抗的塑料容器中预先加满步骤2制得的二抗稀释液，放入37℃恒温箱中干燥孵育90min；甩干容器内液体，得到封闭好的二抗盛放容器，干燥保存在4℃冰箱；用步骤1制得的碳酸盐缓冲液将抗原蛋白稀释成质量体积浓度为5μg/mL的抗原蛋白溶液，并保存在4℃下；在封闭好的抗体盛放容器中，用步骤2中的抗体稀释液将抗体稀释成质量体积浓度为3.34μg/mL的抗体溶液，并保存在4℃下；在封闭好的二抗盛放容器中，用步骤2制得的二抗稀释液将二抗稀释成质量体积浓度为1μg/mL的二抗溶液，并保存在4℃下；步骤4：将步骤3制得的抗原蛋白溶液以每孔100μL加入到酶标板内，加盖放入4℃冰箱中干燥孵育24h，倒出孔内液体，甩干；每孔中加入PBST洗涤液300μL进行洗板，共洗板四次，拍干；然后每孔中加入1%BSA封闭液100μL，在37℃恒温箱中干燥孵育90min后，重复洗板过程四次，拍干；步骤5：用步骤1制得的碳酸盐缓冲液稀释莱克多巴胺标准品，制成九个不同质量体积浓度的莱克多巴胺溶液，该九个莱克多巴胺溶液的质量体积浓度分别为：1ng/mL、4.4ng/mL、2.2ng/mL、1.1ng/mL、0.44ng/mL、0.11ng/mL、0.044ng/mL、0.011ng/mL以及0ng/mL；该九个不同质量体积浓度的莱克多巴胺溶液作为系列标准溶液，将该九种不同浓度的莱克多巴胺溶液各自与质量体积浓度为3.34μg/mL的抗体溶液等体积混合，在37℃恒温箱中干燥孵育10min后，以每孔100μL加入到步骤4制备好的酶标板中，在37℃恒温箱中干燥孵育30min，反应结束后用步骤4的洗板方法，洗板三次，拍干；将质量体积浓度1μg/mL的二抗溶液以每孔100μL加入到酶标板内，在37℃恒温箱中干燥孵育20min，反应结束后用步骤4的洗板方法，洗板三次，拍干；每孔加入100μL步骤3配制的显色液，放入37℃恒温箱中干燥孵育10min，充分显色；每孔加入50μL步骤3配制的硫酸终止液，轻轻振荡混匀；酶标仪波长设定为450nm，在5min之内测定每孔的吸光值，绘制系列莱克多巴胺标准溶液的工作曲线；同时作空白实验，以空白作参比；步骤6：称取2.00g待测定的纯瘦肉置于50mL离心管中，加4mL甲醇，混匀，超声提取5～10min，5000r/min离心5分钟，取上清液1mL，氮吹仪吹干，用步骤1配制的磷酸盐缓冲液复原至1mL，得样品制备液；步骤7：将样品制备液与抗体溶液等体积混合，在37℃恒温箱中干燥孵育10min后，以每孔100μL加入到步骤4制备好的酶标板中，在37℃恒温箱中干燥孵育30min，反应结束后用步骤4的洗板方法，洗板三次，拍干；将质量体积浓度1μg/mL的二抗溶液以每孔100μL加入到酶标板内，在37℃恒温箱中干燥孵育20min，反应结束后用步骤4的洗板方法，洗板三次，拍干；每孔加入100μL步骤3配制的显色液，放入37℃恒温箱中干燥孵育10min，充分显色；每孔加入50μL步骤3配制的硫酸终止液，轻轻振荡混匀；酶标仪波长设定为450nm，在5min之内测定每孔的吸光值；步骤8：根据步骤7测得的样品制备液的吸光度值，从步骤5绘制的系列莱克多巴胺标准溶液的工作曲线上找到该吸光度值对应的莱克多巴胺的含量，按下式计算待测动物源性制品中莱克多巴胺的含量X：式中：X表示试样中的莱克多巴胺含量，单位μg/kg；C₁表示步骤8测得的样品制备液的吸光度所对应的莱克多巴胺的含量，单位ng/mL；C₀表示试样空白液中莱克多巴胺的含量，单位ng/mL；m表示试样质量，单位g；V₁表示步骤6中样品制备液的总体积，单位mL；V₂表示步骤6中加入甲醇的体积，单位mL。