[发明专利]以IDLV为模板的TALEN靶向基因编辑优化方法

摘要

本发明提供一种以IDLV为模板的TALEN靶向基因编辑优化方法，将同源重组模板插入慢病毒载体中，利用慢病毒的高效转导效率，提高同源重组模板的细胞内递送效率，从而提高TALEN靶向基因编辑技术效率。本发明利用整合酶缺陷的包装质粒包装慢病毒，使含有模板的慢病毒载体不会整合到细胞染色体内发生插入突变，保证了靶向基因编辑技术的安全性。本发明提供了一套完整的利用整合酶缺陷型慢病毒作为同源重组模板胞内导入手段的TALEN靶向基因编辑优化方法。利用本方法，并根据研究目的设计不同TALEN与同源重组模板序列，有望实现任意基因序列的高效靶向编辑。

主权项

一种以IDLV为模板的TALEN靶向基因编辑优化方法，其特征在于，通过以下技术方案实现：（1）TALEN设计和构建：根据需要进行基因编辑的靶序列通过在线TALEN设计网站https://tale‑nt.cac.cornell.edu/分别设计上下游两条特异性TALEN，TALEN哺乳动物表达质粒通过试剂盒内的TALEN酵母表达质粒pTAL3或pTAL4改造获得，TALEN构建方法根据试剂盒说明和文献报道进行；（2）慢病毒质粒模板构建：利用PCR法分别获得目的序列TALEN剪切位点两侧500 bp的同源序列，并将两侧的同源序列依次插入慢病毒骨架质粒中，根据研究需要在同源序列位置构建核苷酸突变，或在同源序列中间插入一段目的序列；（3）整合酶缺陷型慢病毒模板制备：含靶序列同源重组模板的IDLV通过将慢病毒质粒模板、pC‑help和pCMV‑G共转染293T细胞制备，其中pC‑help为整合酶缺陷型病毒包装质粒，具体流程如下：准备50个10‑cm培养皿的293T细胞，融合度为80%，1)转染前一个小时半量换液；2)配制质粒DNA钙磷酸沉淀混合液，其中质粒DNA包括慢病毒质粒模板、pC‑help和pCMV‑G；3)室温孵育30分钟，使DNA与钙磷酸共沉淀；4)将DNA钙磷酸沉淀混合液加入293T细胞；5)37ºC孵箱孵育6‑7小时；6)将培养液更换为含6 mM Na Butyrate的293T新鲜培养液；7)在转染后第24、28和72小时分别收集病毒悬液，0.45µm滤器过滤后，加入三分之一体积的40%PEG，混合均匀后4ºC沉淀过夜；8)待三次病毒液均收集完毕后，混合，4ºC ，12,000转离心1小时；9)弃去上清液，将病毒重悬于30ml培养液中；10)4ºC，24,500转真空超速离心1小时34分钟；11)弃去上清液，将病毒溶解于600 µl 培养液中，分装，‑80ºC保存；（4）TALEN转染：TALEN的细胞内递送采用lipofectamin 2000脂质体转染法，具体步骤以293细胞为例，转染前一天，将293细胞按1:4传代，使细胞在转染当天达到80%融合度；转染当天，将lipofectamin 2000混合均匀后，取5µl稀释于250 µl Opti‑MEM® I培养液中，吹打均匀，室温孵育5分钟；将待转染的TALEN质粒4µg稀释于250 µl Opti‑MEM® I培养液中，吹打均匀，室温孵育5分钟，然后将稀释的lipofectamin 2000与稀释的DNA溶液混合均匀，室温孵育20分钟，最后，将融合度为80%的293细胞用胰酶消化后，以1×106/孔的密度接种于6孔板内，并立即将500 µl孵育好的lipofectamin 2000与DNA混合液加入6孔板中，将细胞与转染试剂混合均匀后，在37°C，5%CO2孵箱中培养；（5）IDLV模板转导：在TALEN转染后24小时，直接在培养液中加入所需体积的病毒液，以及polybrene，终浓度4 µg/ml，转染6小时或过夜后更换新鲜培养液；（6）抗性克隆筛选：根据模板中的抗性基因种类，选择不同的药物从TALEN转染后72小时，即病毒转导后48小时进行抗性筛选，20天后即挑选抗性克隆进行同源重组鉴定；（7）同源重组鉴定：根据目的基因序列，设计特异性探针或引物，采用southern blot或PCR方法进行同源重组鉴定。