[发明专利]一种红豆杉愈伤转化过程中农杆菌侵染的方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，具体为一种红豆杉愈伤转化过程中农杆菌侵染的方法。本发明把红豆杉下胚轴作为外植体诱导愈伤组织，并经过培养获得胚性愈伤；用根癌农杆菌介导，采用农杆菌浸润的刀片切割红豆杉愈伤组织，将带有GUS基因的pCAMBIA1304质粒导入红豆杉愈伤组织，PCR检测外源潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)的整合情况，组织化学方法检测GUS基因在组织中的表达情况，获得红豆杉的转基因愈伤组织；其中，刀面接触在愈伤组织的切面上形成一定的菌液梯度，从而覆盖转化所需的最佳菌液浓度，确保细胞得到成功转化，提高农杆菌转化的成功率，为红豆杉愈伤组织开展高效地遗传转化工程奠定的基础。

主权项

一种红豆杉愈伤转化过程中农杆菌侵染的方法，其特征在于：是在红豆杉愈伤遗传转化过程中，采用农杆菌浸润的刀片切割红豆杉愈伤组织块，使刀面接触的愈伤组织的切面上形成一定的菌液梯度，从而覆盖转化所需的最佳菌液浓度，确保细胞得到成功转化；其中，所述红豆杉愈伤遗传转化过程包括：把红豆杉下胚轴作为外植体诱导愈伤组织，并经过培养获得胚性愈伤；用根癌农杆菌介导，采用农杆菌浸润的刀片切割红豆杉愈伤组织，将带有GUS基因的pCAMBIA1304质粒导入红豆杉愈伤组织；PCR检测外源潮霉素磷酸转移酶基因HPT的整合情况；组织化学方法检测GUS基因在组织中的表达情况，获得红豆杉的转基因愈伤组织；具体操作步骤如下：(1) 红豆杉愈伤组织的诱导培养：选择下胚轴为愈伤组织诱导用外植体，在愈伤组织诱导培养基上进行暗培养，在下胚轴两端逐渐产生白色的愈伤组织，并且不断膨大；上述愈伤组织诱导培养基是以B5培养基为基础，再添加激素NAA、TDZ和2,4‑D而组成；(2) 红豆杉胚性愈伤组织的诱导培养：将下胚轴诱导出的白色愈伤转接入胚性愈伤诱导培养基上，预防水样化和褐化，并获得致密的、硬度增加的胚性愈伤组织；该胚性愈伤诱导培养基是以B5培养基为基础，再添加5种氨基酸和激素2,4‑D、NAA和TDZ 而组成；(3) 遗传转化：利用根癌农杆菌介导，以红豆杉胚性愈伤组织为受体，将含GUS基因的植物表达载体pCAMBIA1304根癌农杆菌浸润的刀片切割愈伤组织，在愈伤组织块内形成菌液浓度梯度，进行遗传转化；(4) 抗性胚性愈伤组织的脱菌、筛选和增殖培养：经过遗传转化，然后在恢复培养基上进行脱菌培养，在筛选培养基上进行筛选培养，获得具有潮霉素抗性的愈伤组织；将抗性愈伤组织接入胚性愈伤组织继代培养基进行增殖培养，增加抗性愈伤组织的数量；(5) PCR检测和GUS组织化学染色方法检测转基因愈伤：PCR检测pCAMBIA1304质粒上带有的潮霉素磷酸转移酶基因；GUS组织化学染色，将愈伤组织浸入配制好的GUS染色液中，37℃染色过夜，愈伤组织中的蓝色为报告基因GUS组织化学染色，表明外源基因已经整合到受体细胞的染色体中并表达；步骤（3）中所述的农杆菌浸润的刀片切割的愈伤组织块体积大小约为1立方厘米，切割为一分为二，并将刀片切割过的愈伤组织断切面即黏附有农杆菌菌液面朝下置于共培养基上培养；所述的共培养基组分为：B5 + 0.5‑2.0 mg/l 的TDZ + 1.0‑2.0 mg/l 的2,4‑D + 1.0‑2.0 mg/l 的NAA + 0.8 g/l 的酪氨酸 + 0.4 g/l 的丙氨酸 + 0.4 g/l 的脯氨酸 + 0.4 g/l 的赖氨酸 + 0.4 g/l 的谷氨酸 + 25 g/l 的蔗糖 + 5 g/l 的植物凝胶。