[发明专利]端黑萤胚胎的玻璃化冷冻保存方法

摘要

本发明公开了端黑萤(Luciola praeusta Kiesenwetter)胚胎的玻璃化冷冻保存及解冻复苏方法，该方法包括端黑萤胚胎的预处理、去壳、与冷冻保护剂混合进行五步平衡处理、平衡处理后的混合物在液氮中冷冻保存、复温和孵育。采用本发明方法冷冻保存端黑萤胚胎，冷冻后的端黑萤存活率高、冻后繁殖率高，能适用于端黑萤不同亚系胚胎的冷冻保存。

主权项

端黑萤胚胎的玻璃化冷冻保存方法，其特征在于，整个过程均在无菌条件下操作，包括以下步骤：(1)选择卵期在10‑20天之间的的端黑萤胚胎；(2)端黑萤胚胎灭菌处理：用萤火虫胚胎灭菌液对选择的端黑萤胚胎进行表面清洁、消毒、杀菌和灭真菌；(3)端黑萤胚胎的去卵壳处理；(4)端黑萤胚胎与冷冻保护液平衡：将端黑萤胚胎置于20％、30％、50％、70％和100％冷冻保护液依次进行五步平衡处理；(5)平衡处理后的端黑萤胚胎与冷冻保护液混合物装入麦管或置于铜箔片上，投入液氮中冷冻保存；(6)从液氮中取出置于复温液中复温；(7)26℃‑28℃、80％‑90％湿度的条件下进行孵育，其中所述的冷冻保护液由基础液、小分子抗冻剂和玻璃化保护剂组成，复温液由基础液和小分子复温剂组成。