[发明专利]分离检测环境中雌激素类内分泌干扰物的方法

摘要

本发明公开了一种分离检测环境中雌激素类内分泌干扰物的方法，包括如下步骤：步骤1：制备重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱，具体步骤如下：1-1）基因工程菌M3中重组受体蛋白的表达；1-2）Ni-NTA亲和层析柱的活化；1-3）雌激素受体蛋白募集；步骤2：通过亲和层析法分离待测混合样品中的雌激素，具体步骤如下：2-1）混合样品浓缩；2-2）将该浓缩液加入到结合缓冲液中得到含待测样品的结合缓冲液，加入的浓缩液的量以不产生沉淀为前提；2-3）亲和分离该含待测样品的结合缓冲液中的雌激素类内分泌干扰物；步骤3：对洗脱液中的雌激素类物质进行色谱检测。

主权项

一种分离检测雌激素类内分泌干扰物的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：制备重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱，具体步骤如下：1‑1）基因工程菌M3中重组受体蛋白的表达：在含有150g/L的蔗糖和50 mg/L的卡那霉素的LB培养基中接入活化后的M3菌种，37 ℃震荡培养至吸光值OD600=0.9‑1.0，光程=1 cm，3小时内降温至15 ℃，加入诱导剂0.5毫摩尔每升异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷继续培养16小时，离心收集菌体；1‑2）Ni‑NTA亲和层析柱的活化：提供Ni‑NTA亲和层析柱，分别以1 mL高纯水1次、1 mL 0.1摩尔每升硫酸镍溶液1次、1 mL高纯水1次和连续3次1 mL平衡缓冲液作为清洗液依次冲洗该Ni‑NTA亲和层析柱，该亲和层析柱中的Ni‑NTA柱材为10 μL‑20μL；1‑3）使用活化后的Ni‑NTA亲和层析柱募集雌激素受体蛋白：以平衡缓冲液重悬步骤1‑1）收集到的菌体；低温超声破碎所述菌体的细胞壁；低温离心收集上清液；将1mL该上清液与活化后的Ni‑NTA亲和层析柱低温混合孵育2小时，并以平衡缓冲液每次1mL，冲洗3次该低温混合孵育后的Ni‑NTA亲和层析柱，即制得所述重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱；步骤2：通过亲和层析法分离待测混合样品中的雌激素类内分泌干扰物，具体步骤如下：2‑1）混合样品浓缩：以0.22 μm滤膜过滤待检测的水样，调节水样pH值到2‑3，将该水样中的非极性有机组分分离并溶解在有机溶剂中，得到浓缩液，该浓缩液中非极性有机组分浓度比在原待测水样中扩大1000‑5000倍；2‑2）将该浓缩液加入到结合缓冲液中得到含待测样品的结合缓冲液，加入的浓缩液的量以不产生沉淀为前提；2‑3）亲和分离该含待测样品的结合缓冲液中的雌激素类内分泌干扰物：将该重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱与1mL含有待测样品的结合缓冲液低温混合孵育不少于12小时，以平衡缓冲液冲洗每次1mL，冲洗3次该与含有待测样品的结合缓冲液低温混合孵育的重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱，加入洗脱缓冲液，对该与含有待测样品的结合缓冲液低温混合孵育的重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱进行洗脱，得到洗脱液；步骤3：对分离的雌激素类内分泌干扰物进行色谱检测。